霍建勇 中國番茄產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及安全防范 蔬菜 苗 衛(wèi) 東 高 換 超 李 俊 濤 等 月 季 無 菌 材 料 的 獲 得 及 不 定 芽 的 誘 導 江 蘇 農(nóng) 業(yè) 科 學 月 季 無 菌 材 料 的 獲 得 及 不 定 芽 的 誘 導 苗衛(wèi)東 高換超 李俊濤 王宇揚 李凱薇 河南科技學院園藝園林學院 河南新鄉(xiāng) 摘 要 月季花大而香 是名貴的觀賞植物 但采用常規(guī)的扦插和嫁接繁殖方法進行繁殖成活率不高 采用霍爾恩 月季一年生枝條為外植體進行離體培養(yǎng)以擴大繁殖系數(shù) 試驗首先以 為基本培養(yǎng)基 添加不同濃度的植物生長 調(diào)節(jié)劑 研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑對月季萌芽率及生長情況的影響 然后用獲得的月季無菌苗葉片為材料 以 為 基本培養(yǎng)基 研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑及暗培養(yǎng)時間等多種因素對霍爾恩月季葉片不定芽誘導再生的影響 結(jié)果表 明 月季腋芽萌發(fā)較適合的培養(yǎng)基為 蔗糖 瓊脂粉 繼代培養(yǎng)較 適合的培養(yǎng)基為 蔗糖 瓊脂粉 對葉片不定芽再生有誘導 作用 最適的培養(yǎng)基為 蔗糖 瓊脂粉 暗培養(yǎng)時間為 葉片的 不定芽最高誘導率為 關(guān) 鍵 詞 霍爾恩月季 無菌苗 葉片 植物生長調(diào)節(jié)劑 不定芽 中 圖 分 類 號 文 獻 標 志 碼 文 章 編 號 收稿日期 作者簡介 苗衛(wèi)東 男 河南遂平人 副教授 主要從事園藝 植物資源評價與利用研究 月季被譽為 花中皇后 是世界上最重要的觀 賞植物之一 以其花朵美麗 四季常開 花色豐富和 香色濃郁 一直被大眾所喜歡 并且它還有非常廣 泛的應用價值 是城市綠化的主要材料 月季的自 然花期為 月至 月 花大型 有香氣 廣泛用于園 藝栽培和切花生產(chǎn) 中國是月季的原產(chǎn)地之一 中國有 個城市把它作為市花 霍爾恩月季是豐 花月季的一個品種 長勢強健 分枝旺盛 株形優(yōu) 美 主干及側(cè)分支不明顯 為灌叢生長 其葉片刺體 與雜種茶香月季相比略小 植株偏矮 通常在 霍爾恩月季花朵顏色呈深玫紅色 重瓣 花 朵直徑 香氣宜人 霍爾恩月季花期不斷 群體 栽植觀賞性較高 現(xiàn)代月季品種有 多個 月季傳統(tǒng)的繁育方法如扦插 嫁接等具有一定的局 限性 繁殖速度慢 種苗容易退化 對月季進行離體 培養(yǎng) 可以在短時間內(nèi)獲得優(yōu)質(zhì)苗 而且可以周年 進行生產(chǎn) 目前 對月季組培的研究主要集中在離 體快繁方面 關(guān)于植株再生體系的建立報道較 少 建立高效的月季再生體系是開展月季基因工程 育種的前提 有關(guān)建立月季再生體系有 條途徑 即器官發(fā)生途徑和體細胞胚途徑 本試驗采用離 體快繁的方法獲得大量的月季無菌材料 用其無菌 材料的葉片作為外植體 通過器官發(fā)生途徑建立了 月季不定芽再生的體系 為月季的轉(zhuǎn)基因奠定了一 江蘇農(nóng)業(yè)科學 年第 卷第 期 定基礎(chǔ) 材 料 與 方 法 材料 試驗于 年 月開展 材料采自河南新 鄉(xiāng)河南科技學院月季種質(zhì)資源圃 采摘的月季品種 為霍爾恩 于 左右選擇生長健壯的植株取 年生長勢好 無病蟲害 芽體飽滿的月季中部枝條 誘導不定芽再生的材料是在河南科技學院園藝植 物組培實驗室經(jīng)過繼代培養(yǎng) 的無菌苗 取其 葉片 方法 月季腋芽初代培養(yǎng) 取 年生長勢好 無病 蟲害 芽體飽滿的月季中部枝條 從大田取回后 除去葉片與莖刺 然后在流水下沖洗 洗去灰 塵 然后加入適量洗潔精沖洗 后剪成帶 個芽 體的莖段 在超凈工作臺上用 氯化汞消毒 然后使用無菌水沖洗 次 每次沖洗 并 不斷搖晃徹底沖洗殘留的氯化汞 用無菌濾紙把接 種材料上的水吸干 把處理好的材料接種于以 為基本培養(yǎng)基 添加不同濃度的 和 組合的 種初代培養(yǎng)基上 設置的培養(yǎng)基分別為 蔗糖 瓊脂粉 值 每種培養(yǎng)基接種 瓶 每瓶 接種 個外植體 重復 次 共 瓶 接種好外植體 后放在培養(yǎng)室進行培養(yǎng) 培養(yǎng)溫度為 光 照度為 月季腋芽繼代培養(yǎng) 培養(yǎng) 后 由于初 代培養(yǎng)時材料帶莖段容易污染 所以把初代培養(yǎng)生 長良好的腋芽剪下 進行轉(zhuǎn)接至以 為基本培 養(yǎng)基 添加不同濃度 和 組合的 種繼代培 養(yǎng)基上 培養(yǎng)基分別 蔗糖 瓊脂粉 值 在培養(yǎng)過程中一旦發(fā)現(xiàn)污染要及時處理 在培 養(yǎng)過程中要不斷觀察其生長情況 月季無菌苗葉片愈傷組織的誘導 選擇生 長勢良好 無污染的繼代培養(yǎng) 的無菌苗 將無 菌苗葉片剪成適當大小 在葉脈中部橫切幾下進行 刻傷 葉背向下分散接種到以 為基本培養(yǎng)基 添 加不同濃度 的 種愈傷組織誘導培養(yǎng)基 上 培養(yǎng)基分別為 蔗糖為 瓊脂粉 為 值為 每種培養(yǎng)基接種 瓶 每 瓶接 個外植體 重復 次 共 瓶 培養(yǎng)溫度為 光照度為 光照 接種 后觀察愈傷組織的狀態(tài)變化 統(tǒng)計愈傷組 織誘導率 愈傷組織誘導率 產(chǎn)生愈傷的外植體 數(shù) 接種外植體數(shù) 月季無菌苗不定芽的誘導 將培養(yǎng) 生 長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至以 為基本培養(yǎng)基 植 物生長調(diào)節(jié)劑 與 不同濃度組合 種不 定芽誘導培養(yǎng)基上 培養(yǎng)基分別為 對照 蔗糖為 瓊脂粉為 值為 每種培養(yǎng)基 接種 瓶 每瓶接 塊愈傷組織 每個組合分別暗 培養(yǎng) 重復 次 共 瓶 然后放置在 培養(yǎng)溫度為 光照度為 光照下培養(yǎng) 及時觀察不定芽誘導情況并在培 養(yǎng) 后統(tǒng)計不定芽誘導率 不定芽誘導率 誘 導出不定芽的愈傷數(shù) 接種的愈傷數(shù) 江蘇農(nóng)業(yè)科學 年第 卷第 期 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用 統(tǒng)計軟件進行分析 試 驗數(shù)據(jù)為 次重復的平均值 結(jié) 果 與 分 析 不同培養(yǎng)基對月季腋芽萌發(fā)率的影響 通過試驗觀察發(fā)現(xiàn)莖段培養(yǎng) 后 腋芽開始 萌動膨大 培養(yǎng) 后芽體高達 初代培養(yǎng) 后芽體長度達 此時開始統(tǒng)計萌發(fā)個數(shù) 然后把生長良好的芽體切 下轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上 從表 可以看出 這 種組合都能使莖段腋芽 萌發(fā) 培養(yǎng)基 較適合腋芽萌發(fā) 萌發(fā)率為 長勢好 圖 培養(yǎng)基腋芽萌發(fā)率最 低 萌發(fā)率為 長勢慢 圖 培養(yǎng)基 與培養(yǎng)基 差異顯著 培 養(yǎng)基 之間差異不顯著 不同培養(yǎng)基對月季繼代培養(yǎng)的影響 通過試驗發(fā)現(xiàn) 腋芽莖段在初代培養(yǎng)基上培養(yǎng) 后把其切下轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基上 生長良 好 葉片開始展開 圖 在 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 后植株高度達 圖 培養(yǎng) 后植株高度達 圖 表 不 同 培 養(yǎng) 基 對 月 季 腋 芽 萌 發(fā) 率 的 影 響 培養(yǎng)基 接種外植體 個 萌發(fā)數(shù) 個 萌發(fā)率 注 表中萌發(fā)率數(shù)據(jù)為平均值 標準差 同列數(shù)據(jù)后不同小寫 字母表示不同培養(yǎng)基間差異顯著 表 至表 同 從表 可以看出 培養(yǎng)基 較適合月季繼代生 長 培養(yǎng)基 與培養(yǎng)基 之間差異不顯著 都適合 其生長 但是 培養(yǎng)基最初植株生長較快 但是在 繼代培養(yǎng)了 后葉片開始變黃 植株質(zhì)量較差 所以只有培養(yǎng)基 最適合月季繼代培養(yǎng) 培養(yǎng)基 最不適合月季的繼代培養(yǎng) 不同培養(yǎng)基對月季無菌苗葉片愈傷組織誘導 的影響 從表 可以看出 培養(yǎng)基中不加 時無 法誘導出愈傷組織 最適合誘導愈傷組織的培養(yǎng)基 為 誘導率最高 為 培養(yǎng)基 誘導率 為 與 之間差異不顯著 說明這 種 江蘇農(nóng)業(yè)科學 年第 卷第 期 表 不 同 培 養(yǎng) 基 對 月 季 繼 代 培 養(yǎng) 的 影 響 培養(yǎng)基 株高 幼苗長勢 生長慢 細弱 生長慢 細弱 生長慢 細弱 生長慢 細弱 生長快 質(zhì)量好 生長較快 質(zhì)量好 生長較快 顏色黃 生長較快 細弱 生長較快 節(jié)間長細弱 培養(yǎng)基都較適合月季愈傷組織的誘導 與 組合 之間差異顯著 其中 與 之間差異顯著性較小 與 之間差異顯著性較大 與 差異顯著性最大 通過試驗發(fā)現(xiàn) 不同濃度的 對愈傷組 織發(fā)生的時間 愈傷組織生長質(zhì)量有很大影響 從 圖 可以看出 當不加 時不能產(chǎn)生愈傷組 織 材料培養(yǎng) 后全部變褐死亡 圖 當加 葉塊在培養(yǎng) 后在靠近切口卷 曲處長出少許的淡綠色愈傷組織 在后期的觀察中 愈傷組織膨大生長緩慢 愈傷組織質(zhì)地緊密 圖 當加入 在培養(yǎng) 后葉柄切 口長出少許的綠色愈傷組織 葉塊開始卷曲上翹長 出少量愈傷組織 后愈傷組織繼續(xù)膨大 后葉塊幾乎長出全部鮮綠色愈傷組織 圖 當加 在培養(yǎng)初期愈傷組織長得很 快 但生長約 后長出的綠色愈傷組織開始變黃 綠色 圖 當加入 在生長 時葉塊切口處開始膨大 但是有很多材料開始 變褐 后期長出的少許愈傷組織不再繼續(xù)膨大 最 后幾乎全部變褐死亡 圖 表 不 同 培 養(yǎng) 基 對 無 菌 苗 葉 片 愈 傷 組 織 誘 導 的 影 響 培養(yǎng)基 接種數(shù) 塊 愈傷組織數(shù) 塊 愈傷組織誘導率 愈傷組織狀態(tài) 無愈傷組織產(chǎn)生 量少 綠色質(zhì)地緊密 量較多 淡綠色 疏松程度適中 量較多 黃綠色 質(zhì)地疏松 量較少 黃綠色或褐色 質(zhì)地疏松 暗培養(yǎng)天數(shù)和不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對月 季不定芽誘導率的影響 從表 可以看出 霍爾恩月季誘導不定芽最適的 培養(yǎng)基為 誘導率最高 與 誘導率最低 說明 在月 季不定芽誘導中起決定性作用 不添加 無法誘 江蘇農(nóng)業(yè)科學 年第 卷第 期 導出不定芽 和其他 個組合差異顯著 和 差異顯著性較小 說明 濃度對不定芽誘導 率影響不大 和 差異顯著 說明 濃度對 不定芽誘導有很大影響 和其他 個組合差異顯 著 在試驗過程中還發(fā)現(xiàn) 月季無菌苗葉片主要在 主脈切口處產(chǎn)生愈傷組織 月季不定芽誘導率很 低 最高誘導率僅為 由圖 可以看出 在 培養(yǎng)基培養(yǎng) 后有芽將要長出 后長出少許 的不定芽 表 不 同 培 養(yǎng) 基 對 月 季 無 菌 苗 不 定 芽 誘 導 率 的 影 響 培養(yǎng)基 接種愈傷數(shù) 塊 出芽愈傷數(shù) 塊 誘導率 討 論 與 結(jié) 論 對月季不定芽誘導的影響 是一種新型的細胞分裂素類似物 它不但 具有很強的細胞分裂素活性 而且還具有生長素的 功能 在基本培養(yǎng)基 上只加 就能誘導赤霞 珠葉片離體再生 對薔薇科植物誘導不定 芽有促進效果 相關(guān)報道表明 對體胚發(fā)生 的作用因植物種類而異 它對體胚發(fā)生的促進作用 與使用濃度和處理時間有關(guān) 眾多研究指出 通過調(diào)節(jié)內(nèi)源植物生長激素起作用 的 誘導能力雖然很強 但是它也有一定的缺陷 有 研究指出 高濃度的 能誘導愈傷組織形成和體 胚的誘導 但抑制芽的生長不利于伸長 再生芽數(shù) 也減少 高麗萍等在建立月季再生體系的研究中 分別采用直接及間接的誘導途徑 建立了薩曼莎月 季的再生體系 生長素促進細胞伸長和細胞分 裂 細胞分裂素誘導芽分化 促進側(cè)芽萌發(fā)生長 細 胞分裂素配合一定的生長素可共同促進月季側(cè)芽 的萌發(fā)與生長 本研究發(fā)現(xiàn) 對不定芽誘導有 明顯影響 低濃度有利于不定芽的誘導 霍爾恩月 季愈傷組織在誘導愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng) 后轉(zhuǎn)到 分化培養(yǎng)基 上 得到不定芽 證明 對不定芽誘導有促進 作用 材料繼代時間對月季不定芽誘導的影響 通過試驗發(fā)現(xiàn) 繼代 左右的植株較適合誘 導出愈傷組織 繼代時間超過 幾乎無法誘導出 愈傷組織 長出的少許愈傷組織變褐嚴重 無法誘 導出不定芽 說明葉片的幼嫩程度對其有一定的 影響 參考相關(guān)資料取繼代 的植株小葉 愈傷 組織誘導率較高 同時有研究指出 隨著愈傷組 織繼代次數(shù)的增加 愈傷組織分化的能力也不斷下 降 當繼代次數(shù)超過 次 大部分的愈傷組織就幾乎 沒有增殖的能力 本試驗也發(fā)現(xiàn)愈傷組織不能 進行多次繼代 即使此試驗繼代次數(shù)較少 其分化 情況依然不理想 暗培養(yǎng)時間對月季不定芽誘導的影響 在植物離體再生研究中 暗培養(yǎng)時間對再生效 率有著非常重要的作用 暗培養(yǎng)時間過短不能誘 導再生出不定芽 過長植物材料幾乎變褐死亡 通 過試驗發(fā)現(xiàn) 不進行暗培養(yǎng)不能產(chǎn)生不定芽 在試 驗過程中發(fā)現(xiàn)當暗培養(yǎng)時間為 時鮮綠色的愈傷 組織開始轉(zhuǎn)為淡綠色 質(zhì)地開始變得稍疏松 當暗 培養(yǎng)時間為 時愈傷組織過于結(jié)實 開始變黃褐 色 愈傷組織膨大緩慢 暗培養(yǎng) 長出的愈傷組 織不再膨大 開始變黃變褐死亡 所以在不定芽誘 導過程中采用 暗培養(yǎng)然后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng) 培養(yǎng) 條件同月季初代培養(yǎng) 月季的再生培養(yǎng)中不同 和 的濃度組合對不定芽誘導有一定影響 在誘導不定芽階段 暗培養(yǎng)時間起著決定性的作 用 有研究表明 適當?shù)陌蹬囵B(yǎng)時間能促進月季植 江蘇農(nóng)業(yè)科學 年第 卷第 期 株再生 本試驗也發(fā)現(xiàn)適當?shù)陌蹬囵B(yǎng)有助于 不定芽的誘導 霍爾恩月季不定芽誘導暗培養(yǎng)的最 佳時間是 不定芽在產(chǎn)生愈傷組織的切口處產(chǎn) 生 相關(guān)研究指出 暗培養(yǎng) 以上不定芽的再生 率可達到 以上 植株的再生率達到 以 上 本試驗發(fā)現(xiàn) 暗培養(yǎng)時間達到 時愈傷組 織幾乎全變褐 無法誘導出不定芽 碳源濃度對月季不定芽誘導的影響 碳源的種類對植株再生有很大的影響 它除為 細胞生命活動提供能源外 在培養(yǎng)基中還起著維持 一定滲透壓的作用 果糖和乳糖抑制植株再生 蔗 糖和葡萄糖能提高不定芽的誘導率使植株獲得較 高的轉(zhuǎn)化效率 通過試驗發(fā)現(xiàn) 低濃度的蔗糖更 有利于月季無菌體系的建立與不定芽的再生 對月季不定芽誘導的影響 相關(guān)研究指出 不同濃度的細胞分裂素與生長 素組合使用 植株再生效果有很大差異 有研究 表明 與 組合使用時 薔薇植物的再生率 較高 月季愈傷組織在 濃度為 時分 化出不定芽緩慢而且質(zhì)量差 濃度為 時 在愈傷組織中誘導出不定芽的時間短 質(zhì)量好 但是也發(fā)現(xiàn)在此濃度時愈傷組織有時無法誘導出 不定芽而會誘導出多條根 說明生長素濃度高時有 利于生長出根 但是卻無法在不定芽上誘導出根 所以對于建立霍爾恩月季不定芽再生體系還要進 一步研究 褐化現(xiàn)象對月季不定芽誘導的影響 相關(guān)研究認為 植株必須具有 以上的再生 頻率 每個植物材料都能誘導出叢生芽 只有這樣 才具有能成功轉(zhuǎn)化的可能 雖然本試驗做了很 多對比研究 但是不定芽誘導率還是很低 原因主 要是月季葉片在誘導愈傷組織的過程中容易褐化 無法得到不定芽 得到的少數(shù)不定芽無法生根長成 完整植株 相關(guān)研究指出 在植物組織培養(yǎng)過程中 褐化現(xiàn)象的發(fā)生也會影響根的生成 所以 在今 后的工作中應該考慮如何控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生 提 高植株不定芽誘導率并使其長成完整植株 本試驗中選用月季無菌苗葉片為材料 以 為基本培養(yǎng)基 采用離體快繁技術(shù)研究不同植物生 長調(diào)節(jié)劑及暗培養(yǎng)時間等多種因素對霍爾恩月季 葉片不定芽誘導再生的影響 研究得出最適的培 養(yǎng)基為 蔗糖 瓊脂粉 暗培養(yǎng)時間為 葉 片的不定芽最高誘導率為 參 考 文 獻 張佐雙 朱秀珍 中國月季 北京 中國林業(yè)出版社 李 青 蘇雪痕 李湛東 藤本月季組織培養(yǎng)快繁研究 北京 林業(yè)大學學報 高莉萍 包滿珠 月季的植株再生及遺傳轉(zhuǎn)化研究進展 植 物學通報 田傳衛(wèi) 尚愛芹 張建甫 等 多花薔薇假珠芽誘導 體細胞胚發(fā) 生及植株高效再生 園藝學報 王 禹 微型月季組織培養(yǎng)育苗技術(shù) 中國林副特產(chǎn) 王錢錢 五種月季品種的快繁和再生體系的優(yōu)化探究 合 肥 安徽農(nóng)業(yè)大學 劉子平 趙春莉 李金英 等 紅雙喜月季高效組織培養(yǎng)快繁技術(shù) 福建農(nóng)業(yè)學報 劉亞娟 楊小艷 謝樹章 等 芳純月季組培快繁技術(shù)研究 西南師范大學學報 自然科學版 高莉萍 包滿珠 月季薩蔓莎不定芽的直接誘導和植株再生的 研究 中國農(nóng)業(yè)科學 郭艷超 田傳衛(wèi) 尚愛芹 等 粉團薔薇葉片不定芽的直接誘導 及植株再生 分子植物育種 增刊 潘兵兵 個現(xiàn)代月季品種愈傷組織再生體系的建立與體細胞 培養(yǎng)的研究 哈爾濱 東北農(nóng)業(yè)大學 楊 濤 錢 蕾 呂永桂 等 豐花月季低成本組織培養(yǎng)快繁的 研究 江蘇農(nóng)業(yè)科學 李敬蕊 月季再生體系的建立及葉盤法轉(zhuǎn)化月季 薩蔓莎 的研 究 武漢 華中農(nóng)業(yè)大學 林桂玉 李美芹 呂金浮 等 藤本月季紫皇后組織培養(yǎng)技術(shù) 江蘇農(nóng)業(yè)科學 楊永花 張美玲 張新瑞 等 藤本月季組織培養(yǎng)初報 甘肅 農(nóng)業(yè)大學學報 徐凌飛 馬鋒旺 王喆之 等 梨葉片離體培養(yǎng)和植株再生 園藝學報 賈士榮 曹冬孫 轉(zhuǎn)基因植物 植物學通報 張俊琦 羅曉芳 牡丹組織培養(yǎng)中褐化的發(fā)生原因與防止方法 的研究 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報 江蘇農(nóng)業(yè)科學 年第 卷第 期