園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1446 1456 Acta Horticulturae Sinica 1446 doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0630 http www ahs ac cn 收稿日期 2020 12 10 修回日期 2021 04 26 基金項(xiàng)目 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專項(xiàng) CAAS ASTIP 2020 ZFRI 河南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 20230041053 212300410419 通信作者 Author for correspondence E mail liming06 0371 65330965 甜櫻桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 齊希梁 劉聰利 宋露露 李 明 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所 鄭州 450009 摘 要 從甜櫻桃基因組中鑒定了 4 個(gè)磷酸蔗糖合酶 sucrose phosphate synthase SPS 基因 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析表明 PavSPSA1 在甜果實(shí)發(fā) 育和成熟過(guò)程中表達(dá)量最高 其次是 PavSPSC PavSPSA2 和 PavSPSB 表達(dá)量較低 PavSPSA1 和 PavSPSA2 在果實(shí)成熟軟化過(guò)程中均上調(diào)表達(dá) 與甜櫻桃果實(shí)的成熟軟化過(guò)程吻合 通過(guò)利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默 VIGS 技術(shù)沉默 PavSPSA1 甜櫻桃果實(shí)蔗糖含量降低 果實(shí)著色和果實(shí)成熟軟化延遲 沉默 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 甜櫻桃果實(shí)蔗糖含量 果實(shí)著色和果實(shí)成熟軟化與對(duì)照無(wú)差異 推測(cè) PavSPSA1 或許是調(diào)控果實(shí)蔗糖合成與積累的關(guān)鍵基因 影響果實(shí)著色和成熟軟化 關(guān)鍵詞 甜櫻桃 磷酸蔗糖合酶 PavSPSA1 基因表達(dá) 果實(shí)成熟 基因沉默 中圖分類號(hào) S 662 5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2021 08 1446 11 Functional Analysis of Sucrose phosphate Synthase Genes SPS in Sweet Cherry QI Xiliang LIU Congli SONG Lulu and LI Ming Zhengzhou Fruit Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences Zhengzhou 450009 China Abstract In order to ascertain the function of sucrose phosphate synthase genes SPS in the regulation of sweet cherry ripening four full length cDNA of sweet cherry SPS genes PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC were cloned in sweet cherry genome Gene expression analysis showed that the expression levels of PavSPSA1 was the highest followed by PavSPSC whereas PavSPSA2 and PavSPSB were relatively weakly expressed during the fruit growth and development and ripening using quantitative real time PCR The expression levels of PavSPSA1 and PavSPSA2 coincided with fruit ripening and softening Furthermore we used TRV mediated virus induced gene silencing VIGS to evaluate the function of PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC in the regulation of ripening The results showed that silencing PavSPSA1 gene decreased sucrose content delayed fruit coloring ripening and softening However The fruit phenotypes for the PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC silenced fruits showed no visible defects when compared with the control fruits Taken together our findings determined that PavSPSA1 may be a key gene regulating sucrose synthesis and accumulation in sweet cherry fruit and play an indispensable role in the regulation of sweet cherry fruit ripening and softening 齊希梁 劉聰利 宋露露 李 明 甜櫻桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1446 1456 1447 Keywords sweet cherry sucrose phosphate synthase PavSPSA1 gene expression fruit ripening VIGS 歐洲甜櫻桃 Prunus avium L 是目前北方落葉果樹(shù)中栽培效益較好且上市最早的鮮果 Li et al 2010 McCune et al 2010 張開(kāi)春 等 2017 Kelley et al 2018 但果實(shí)成熟后迅速軟化 品 質(zhì)下降 不僅降低了商品價(jià)值 且增大了運(yùn)輸成本和縮短了貨架期 鑒定調(diào)控果實(shí)成熟軟化的關(guān)鍵 轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將有助于更好地認(rèn)識(shí)果實(shí)成熟與軟化的過(guò)程 為提高果實(shí)的耐貯藏能力提 供有力的科學(xué)依據(jù) 蔗糖不僅決定果實(shí)的風(fēng)味和品質(zhì) 同時(shí)也是一種信號(hào)因子 在果實(shí)發(fā)育和成熟軟化過(guò)程中起重 要作用 Wind et al 2010 Jiang et al 2012 Jia et al 2013 2016 蔗糖磷酸合酶 sucrose phosphate synthase SPS 是植物體內(nèi)控制蔗糖合成的關(guān)鍵酶 催化尿苷二磷酸葡糖 UDPG 和果糖 6 磷 酸 F6P 生成蔗糖 6 磷酸 S6P 此反應(yīng)不可逆 SPS 在高等植物中是多基因家族編碼的蛋白 不同物種中 SPS 成員數(shù)量不同 且同一物種中不同家族成員調(diào)控蔗糖合成的能力各不相同 Lunn MacRae 2003 Castleden et al 2004 目前已在擬南芥 Langenk mper et al 2002 可可 李 付鵬 等 2015 桃 Vimolmangkang et al 2016 柑橘 魏清江 等 2020 和荔枝 Wang et al 2018 中鑒定出 4 個(gè) SPS 基因 蘋(píng)果 李會(huì)霞 等 2017 和梨 呂佳紅 等 2018 中鑒定出 8 個(gè) SPS 基因 且越來(lái)越多的研究表明 SPS 在植物蔗糖合成和積累 生長(zhǎng)發(fā)育 果實(shí)糖代謝及成熟與 軟化 非生物逆境脅迫的響應(yīng)等過(guò)程中起重要作用 Verma et al 2011 Hirose et al 2014 Wang et al 2017 呂佳紅 等 2018 Nemati et al 2018 魏清江 等 2020 因此 研究果實(shí)中 SPS 基 因的表達(dá)調(diào)控及作用機(jī)理 對(duì)了解果實(shí)中蔗糖代謝與積累 果實(shí)品質(zhì)形成和成熟軟化具有重要意義 目前尚未見(jiàn)有關(guān)甜櫻桃 SPS 基因家族功能分析的報(bào)道 尚不清楚哪個(gè) SPS 基因在甜櫻桃蔗糖合成和 果實(shí)成熟軟化過(guò)程中起關(guān)鍵作用 因此 為探明甜櫻桃 SPS 基因家族在果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中的功 能 從甜櫻桃基因組中分離了 4 個(gè) SPS 基因 研究了其在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中基因的表達(dá)模式 并利用 病毒誘導(dǎo)的基因沉默 VIGS 技術(shù)分析其在甜櫻桃果實(shí)成熟軟化中的分子功能 以期為進(jìn)一步研究 甜櫻桃 SPS 基因在果實(shí)成熟軟化的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)于 2018 2019 年進(jìn)行 供試歐洲甜櫻桃栽培品種為 布魯克斯 種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 鄭州果樹(shù)研究所櫻桃種質(zhì)資源圃 砧木為 ZY 1 樹(shù)齡 8 年 樹(shù)體生長(zhǎng)正常 VIGS 載體為煙草脆裂病毒 tobacco rattle virus TRV 載體 pTRV1 與 pTRV2 由清華大學(xué)劉 玉樂(lè)教授惠贈(zèng) 1 2 甜櫻桃 SPS 基因家族鑒定 以擬南芥基因組中已知的 4 個(gè) SPS 基因 At5g20280 At5g11110 At1g04920 和 At4g10120 編碼的氨基酸序列作為參考 在甜櫻桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù) http cherry kazusa or jp map html 中進(jìn)行 比對(duì)搜索 獲得相似性高的序列 通過(guò) Uniprot http www uniprot org 和 Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù) http pfam xfam org 檢測(cè)所獲得序列的保守結(jié)構(gòu)域 將含有蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域 Sucrose synth Qi Xiliang Liu Congli Song Lulu Li Ming Functional analysis of sucrose phosphate synthase genes SPS in sweet cherry 1448 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1446 1456 PF00862 糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域 Glycos transf 1 PF00534 和蔗糖 6 磷酸磷酸水解酶結(jié)構(gòu)域 S6PP PF05116 的序列作為甜櫻桃 SPS 基因家族候選序列 1 3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR qRT PCR 分析甜櫻桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中 PavSPS 的表達(dá) 收集不同發(fā)育期和 TRV 病毒侵染的 布魯克斯 果實(shí) 利用 RNAprep Pure 多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒 天根生物科技有限公司 北京 中國(guó) 提取經(jīng) DNaseI 酶消化的總 RNA 并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 設(shè)計(jì)特異性引物對(duì) PavSPSA1 q F R PavSPSA2 q F R PavSPSB q F R 和 PavSPSC q F R 表 1 進(jìn)行 3 次獨(dú)立的熒光定量 PCR 分析甜櫻桃 PavSPS 和成熟相關(guān)基因的表達(dá)模式 qRT PCR 反應(yīng)在 ABI7500 PCR 熱循環(huán)儀 Applied Biosystems Foster City CA United States 上進(jìn)行 使 用 TransStart Top Green qPCR SuperMix 北京全式金生物技術(shù)有限公司 北京 中國(guó) 試劑盒進(jìn)行 反應(yīng) 以甜櫻桃的 Histone2 Pav sc0000671 1 g260 為內(nèi)參基因進(jìn)行分析 3 次生物學(xué)重復(fù) 取平 均值 采用 2 ct 方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量 表 1 本研究中所用的引物信息 Table 1 Primers used in this study 引物名稱 Primer name 序列 5 3 Sequence 引物名稱 Primer name 序列 5 3 Sequence PavSPSA1 F ATGGCGAGCAACGATTGGATAAAC PavSPSA1 J F CAGGTTCATGCCCCGCATGGTGA PavSPSA1 R CTACGTCTTGACAACTCCGAGTT PavSPSA1 J R ATTGTGGATGCCTTGGTTTGC PavSPSA2 F ATGGCGGGAAACGACTGGGTGAAC PavSPSA2 J F GAGGCAGCAGCTTATGGTCTACCT PavSPSA2 R CTACCGCTTGAGAATCCCTAGT PavSPSA2 J R CTTGTCCTTCCCTGCTGCCTCA PavSPSB F ATTTGGCATCTTACCCGTAAGAAG PavSPSB J F ATGAAGGAGGTGGAAATAAGCTGCT PavSPSB R TCACATTCGAGCAGCAGATTTAGAG PavSPSB J R AGTACATTGGATGGCAACGCAG PavSPSC F ATGGCGGGAAACGACTGGTTAAACAG PavSPSC J F GAGATTCTGATACAGGTGGTCAGGT PavSPSA1 q F GCAAACCAAGGCATCCACAAT PavSPSC J R AGCTCCTCAGCCTCGATCCTCTTC PavSPSA1 q R GAACCCTACAGAGCCTTCAGT PaNCED1 F CATGTCGGAGGACGACTTGCCGT PavSPSA2 q F TGAGGCAGCAGGGAAGGACAAG PaNCED1 R GCGCCGTCTGGAGAGACGTGGA PavSPSA2 q R AGCCCCAACGGACATACAGATACC PaPG1 F ATCACCTTCCGCATTGCTG PavSPSB q F GGCTTGCTTGTGGACCCTCAT PaPG1 R TCACCTTAATGTTGTTGGAG PavSPSB q R AGCAGCTTATTTCCACCTCCTTC PaXYL1 F ACAACTGGAACGGTGTCGAT PavSPSC q F ACCCCACCACCCGCTTTCA PaXYL1 R TCCTGGTGTAATGTTGCTCG PavSPSC q R GACCCTCGCCATTGCCTACG PaPL 1 F GATGGTCGCTTCTATGTTGTCA PavSPSA2 RNAi F AGTAAGGTTACCGAATTCTGAGGCAGCAGGGA AGGACAAG PaPL 1 R TGAGATGGAGAGCTCCTCACC PavSPSA2 RNAi R GAGCTCGGTACCGGTACCAGCCCCAACGGACA TACAGATACC PaPAL F GCCTCACCAGGCAACAAGAGCA PavSPSB RNAi F AGTAAGGTTACCGAATTCGGCTTGCTTGTGGAC CCTCAT PaPAL R TCTGGCCATCTGGTCCAACAGC PavSPSB RNAi R GAGCTCGGTACCGGTACCAGCAGCTTATTTCCA CCTCCTTCAT PaCHS F GTATGTGCGAGTACATGGCA PavSPSC RNAi F AGTAAGGTTACCGAATTCACCCCACCACCCGCT TTCA PaCHS R GCTTAGTGAGCTGATAGTC PavSPSC RNAi R GAGCTCGGTACCGGTACCGACCCTCGCCATTGC CTACG PaDFR F CTGCACCGGAGTGTTCCATGT Histone2 F GGTGTGCTTCCGCAGATAA PaDFR R CTGGTGCTCTTCGACGTTCAC Histone2 R TCCTCCTTGGGTGGTGAAT PaANS F ATCTCCGATGAGCTCATGG PaANS R CTCAATGTAATCAGCAGGTG 1 4 VIGS PavSPS 重組載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 載體 pTRV2 PavSPSA1 pTRV2 PavSPSA2 pTRV2 PavSPSB 和 pTRV2 PavSPSC 的構(gòu)建采用 In Fusion Cloning 技術(shù) 以甜櫻桃果實(shí)的 cDNA 為模板 分別設(shè)計(jì)帶有 16 個(gè)重疊區(qū)域 與經(jīng) EcoR 齊希梁 劉聰利 宋露露 李 明 甜櫻桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1446 1456 1449 和 Kpn 線性化的 pTRV2 片段互為反向互補(bǔ)的接頭 的 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 基因特異性引物對(duì) PavSPSA1 RNAi F R PavSPSA2 RNAi F R PavSPSB RNAi F R 和 PavSPSC RNAi F R 表 1 擴(kuò)增基因片段 然后利用 In Fusion TM HD Cloning kit Clontech Mount ain View CA United States 分別將基因片段構(gòu)建連接到經(jīng) EcoR 和 Kpn 雙酶切線性化的 pTRV2 載體上 分別命名為 pTRV2 PavSPSA1 pTRV2 PavSPSA2 pTRV2 PavSPSB 和 pTRV2 PavSPSC 并轉(zhuǎn)入大 腸桿菌 DH5 感受態(tài)細(xì)胞中 挑取陽(yáng)性菌株 經(jīng) PCR 鑒定 雙酶切鑒定和測(cè)序正確后 分別將上述 載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌種 GV3101 中備用 1 5 VIGS 技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化甜櫻桃果實(shí) VIGS 參照齊希梁等 2018 和 Fu 等 2005 的方法進(jìn)行 選取花后 25 d 的甜櫻桃果實(shí) 黃白 期 通過(guò)注射壓迫法將含有 pTRV2 pTRV2 PavSPSA1 pTRV2 PavSPSA2 pTRV2 PavSPSB 或 pTRV2 PavSPSC 載體與 pTRV1 載體的混合菌液從果實(shí)果柄處注射 果實(shí)表面顏色改變表示注射液 擴(kuò)散到果實(shí)組織 注射后的甜櫻桃果實(shí)發(fā)育階段的溫度和濕度要控制低一些 溫度不宜超過(guò) 25 濕度控制在 30 70 并套袋 3 d 后去除果袋 每次選擇 1 株健壯的植株 每種混合菌液注射 果實(shí) 60 個(gè)以上 進(jìn)行 3 次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù) 侵染 14 d 后 提取甜櫻桃果實(shí)的總 mRNA 并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 以甜櫻桃的 Histone2 Pav sc 0000671 1 g260 為內(nèi)參基因 對(duì)不同樣品的 cDNA 含量進(jìn)行調(diào)節(jié) 然后分別利用 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 特異性引物對(duì) PavSPSA1 J F R PavSPSA2 J F R PavSPSB J F R 或 PavSPSC J F R 表 1 檢測(cè)基因沉默后 PavSPS 的表達(dá)水平 1 6 甜櫻桃果實(shí)硬度 可溶性糖 花青素和 ABA 含量的測(cè)定 果實(shí)硬度用 GY 4 型硬度計(jì)測(cè)定 每次隨機(jī)選取 5 個(gè)果實(shí) 不削果皮 每個(gè)果實(shí)不同部位選 2 個(gè)點(diǎn)測(cè)定 P 2 柱狀探頭 直徑 1 mm 測(cè)前速度為 0 5 mm s 1 測(cè)定速度為 1 mm s 1 測(cè)后速度 為 1 mm s 1 穿刺深度為 10 mm 重復(fù) 3 次 取平均值 可溶性糖 蔗糖 葡萄糖和果糖 含量的測(cè)定參考 Jia 等 2013 的方法 并有所改動(dòng) 稱取 0 5 g 在液氮中充分研磨的櫻桃果實(shí)粉末 加入 80 乙醇的溶液 10 mL 80 水浴浸提 20 min 10 000 g 離心 10 min 上清液收集到 25 mL 的容量瓶中 剩余沉淀重復(fù)上述步驟 1 次 取提取液 2 mL 于 10 000 g 離心 10 min 上清液過(guò) 0 45 m HPLC 尼龍網(wǎng) MEMBRANA Germany 然后 通過(guò)高效液相色譜法 HPLC 測(cè)定葡萄糖 果糖和蔗糖含量 檢測(cè)條件 色譜柱 6 5 300 mm Sugar Pak TM I Column Waters 柱溫 60 檢測(cè)溫度 50 流動(dòng)相 超純水 流速 0 5 mL min 1 進(jìn)樣體積 20 L 花青素的測(cè)定參考 Cheng 和 Breen 1991 的方法 用 1 預(yù)冷的鹽酸 乙醇溶液在冰上萃取果 皮 隨后 4 下 10 000 g 離心 30 min 利用差異 pH 測(cè)定法測(cè)定總花青素含量 用每 1 g 鮮質(zhì)量 果實(shí)中矢車菊素 3 葡萄糖苷當(dāng)量表示 ABA 含量的測(cè)定采用高效液相色譜法 準(zhǔn)確稱取在液氮中研磨成粉末的果肉樣品 1 g 加入 80 甲醇溶液 5 mL 靜止 10 min 10 000 g 離心 20 min 上清液過(guò)活化 15 mL 100 甲醇和 15 mL 0 4 乙酸預(yù)處理過(guò) 后的 C18 Sep Pak 固相凈化柱 Waters Ltd Mississauga ON Canada 用 15 mL 10 體積比 甲醇 0 4 乙酸從 Sep Pak C18 柱上洗脫下 ABA 過(guò) 0 22 m 膜過(guò)濾后 用 HPLC 島 津 進(jìn)行 ABA 含量的測(cè)定 測(cè)定條件為 柱溫 35 流動(dòng)相為 A 甲醇 B 水 含 1 乙酸 4 6 流速 1 0 mL min 1 ABA 約在 22 min 出現(xiàn)峰值 Qi Xiliang Liu Congli Song Lulu Li Ming Functional analysis of sucrose phosphate synthase genes SPS in sweet cherry 1450 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1446 1456 花青素 ABA 含量和可溶性糖 蔗糖 葡萄糖和果糖 測(cè)定 進(jìn)行 6 次生物學(xué)重復(fù) 每次 3 個(gè) 樣本 取平均值 1 7 數(shù)據(jù)處理 使用 Microsoft Excel 2010 軟件對(duì)所獲數(shù)據(jù)處理并繪圖 花青素 ABA 含量 可溶性糖 蔗糖 葡萄糖和果糖 含量和果實(shí)硬度數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS17 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和相關(guān)性分析 采用 One way ANOVA 方法對(duì)每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行 Duncan s 檢驗(yàn) P 0 01 2 結(jié)果與分析 2 1 甜櫻桃 SPS 家族基因的分離和表達(dá)模式分析 通過(guò)對(duì)甜櫻桃基因組數(shù)據(jù)搜索和鑒定篩選 共獲得 4 個(gè) SPS 基因 根據(jù)其與擬南芥 SPS 基因的 進(jìn)化關(guān)系及其所屬的亞家族 AtSPS1F 和 AtSPS2F 屬于 亞家族 AtSPS3F 屬于 B 亞家族 AtSPS4F 屬于 C 亞家族 分別命名為 PavSPSA1 Pav sc0000311 1 g960 PavSPSA2 Pav sc0001015 1 g350 PavSPSB Pav sc0006188 1 g050 和 PavSPSC Pav sc0000500 1 g060 其中 PavSPSA1 PavSPSA2 和 PavSPSC 分別定位在甜櫻桃第 7 1 和 8 號(hào)染色體上 而 PavSPSB 的染色體位置未知 表 2 此 外 PavSPS 蛋白與擬南芥的同源蛋白序列相似性較高 67 35 77 69 表 2 表 2 甜櫻桃基因組中 SPS 基因的相關(guān)信息 Table 2 Information of sucrose phosphate synthase SPS genes identified in sweet cherry 基因名稱 Gene name cDNA bp 氨基酸 Amino acid GenBank 登錄號(hào) ID in GenBank 染色體位置 Chromosome location 擬南芥同源基因 Homologous gene in Arabidopsis TAIR 位置 Locus in TAIR 氨基酸相似度 Similarity of amino acid PavSPSA1 3 174 1 057 XM 021953379 1 Chr7 18 650 177 18 655 575 AtSPS1F At5g20280 77 69 PavSPSA2 3 180 1 059 XM 021966658 1 Chr1 35 009 999 35 016 230 AtSPS2F At5g11110 71 36 PavSPSB 2 844 947 XM 021946233 1 chrUn 91 085 245 91 090 791 AtSPS3F At1g04920 67 35 PavSPSC 3 072 1 023 XM 021957268 1 Chr8 324 800 330 670 AtSPS4F At4g10120 72 10 測(cè)定幼果膨大期 花后 7 17 d 硬核期 花后 18 25 d 成熟膨大期 花后 26 45 d 和 成熟軟化期 花后 45 d 以后 甜櫻桃果實(shí) 圖 1 中果糖 葡萄糖和蔗糖的含量 圖 2 A 同時(shí) 分析 4 個(gè) SPS 基因在不同果實(shí)發(fā)育階段的表達(dá)情況 圖 2 B PavSPSA1 在甜櫻桃果實(shí)發(fā)育和成 熟的過(guò)程均高表達(dá) 其次是 PavSPSC 而 PavSPSA2 和 PavSPSB 表達(dá)量較低 PavSPSA1 的表達(dá)量 從花后 28 d 逐漸升高 花后 49 d 最高 之后降低 PavSPSA2 在果實(shí)發(fā)育前期表達(dá)量相對(duì)較低 0 14 d 花后 21 d 逐漸升高 在花后 42 和 56 d 出現(xiàn) 2 個(gè)峰值 表達(dá)量是花后 7 d 的 5 9 倍和 5 7 倍 在果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中 PavSPSB 表達(dá)量一直相對(duì)較低 在果實(shí)發(fā)育前期 0 28 d 略高 花后 14 d 顯著降低 為花后 7 d 的 42 隨后快速升高 花后 28 d 達(dá)到峰值 之后又迅速降低 PavSPSC 在果實(shí)發(fā)育前期 0 21 d 表達(dá)量相對(duì)低一些 花后 28 d 開(kāi)始表達(dá)量迅速逐漸升高 花后 35 d 最 高 之后有所降低 是花后 7 d 表達(dá)水平的 2 5 倍 3 0 倍 綜上 PavSPSA1 和 PavSPSA2 在果實(shí) 成熟軟化過(guò)程中均上調(diào)表達(dá) 或許可能與甜櫻桃果實(shí)成熟軟化有關(guān) 齊希梁 劉聰利 宋露露 李 明 甜櫻桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1446 1456 1451 圖 1 甜櫻桃果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表型 Fig 1 Phenotypes of sweet cherry fruit at different growth and developmental stages 圖 2 甜櫻桃各發(fā)育時(shí)期果糖 葡萄糖和蔗糖的含量變化 A 及 PavSPS 的表達(dá) B Fig 2 Changes in fructose glucose and sucrose contents A and expression profile of PavSPS B during fruit growth and development of sweet cherry 2 2 TRV 介導(dǎo) PavSPS 沉默的表型觀察 與 TRV 空白對(duì)照 侵染的甜櫻桃果實(shí)相比 TRV PavSPSA1 TRV PavSPSA2 TRV PavSPSB 或 TRV PavSPSC 侵染甜櫻桃果實(shí)中對(duì)應(yīng)的 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 的表達(dá)量 顯著降低 圖 3 A 表明甜櫻桃果實(shí)中 4 個(gè) SPS 基因均被有效沉默 侵染 21 d 后 觀察對(duì) PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 沉默的甜櫻桃果實(shí)的表型 TRV 侵染的果實(shí)表皮顏色呈深紅色 而 TRV PavSPSA1 侵染的呈黃白色或黃綠色 甚至淺綠色 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 侵染的呈深紅色 與 TRV 侵染的沒(méi)有顯著差別 圖 3 B 上述 結(jié)果表明沉默 PavSPS1 會(huì)延遲果實(shí)著色和果實(shí)成熟 暗示 PavSPSA1 可能調(diào)控甜櫻桃果實(shí)成熟和軟 化 Qi Xiliang Liu Congli Song Lulu Li Ming Functional analysis of sucrose phosphate synthase genes SPS in sweet cherry 1452 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1446 1456 圖 3 PavSPS 沉默后甜櫻桃果實(shí) PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 基因相對(duì)表達(dá)量變化 A 及果實(shí)表型 B Fig 3 Quantify of PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC genes A in gene silenced sweet cherry fruit and phenotype B 2 3 沉默 PavSPSA1 延遲了甜櫻桃果實(shí)成熟軟化 花后 55 d 空載對(duì)照侵染的甜櫻桃完全成熟 TRV PavSPSA1 TRV PavSPSA2 TRV PavSPSB 和 TRV PavSPSC 侵染的甜櫻桃果實(shí)成熟軟化的特征指標(biāo) 結(jié)果 圖 4 圖 5 顯示 與對(duì)照 TRV 相比 TRV PavSPSA1 侵染的甜櫻桃果實(shí)中花青素與 ABA 含量顯著降低 果實(shí)硬度顯著升高 表 明 PavSPSA1 可能調(diào)控甜櫻桃果皮著色和影響果實(shí)軟化 圖 4 沉默 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 的甜櫻桃果實(shí)中花青素和 ABA 含量 顯著性差異分析采用 One way ANOVA 方法對(duì)每個(gè)變量進(jìn)行鄧肯氏檢驗(yàn) 表示達(dá)到顯著性差異水平 P 0 01 下同 Fig 4 Effect of silencing of PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC in sweet cherry fruits on anthocyanin and ABA Statistically significant differences between means were determined using one way analysis of variance ANOVA at the 1 significance level indicates significant differences P value 0 01 The same below 對(duì)于可溶性糖 果糖 葡萄糖 蔗糖 含量 與對(duì)照 TRV 相比 TRV PavSPSA1 侵染的果實(shí) 的蔗糖含量顯著降低 而果糖和葡萄糖的含量沒(méi)有顯著變化 圖 5 表明 PavSPSA1 或許是調(diào)控蔗 糖合成的關(guān)鍵基因 TRV PavSPSA2 TRV PavSPSB 和 TRV PavSPSC 侵染的甜櫻桃果實(shí)中的花青素 ABA 可溶性糖成分 果糖 葡萄糖和蔗糖 含量和果實(shí)硬度與對(duì)照相比都沒(méi)有顯著差異 圖 4 圖 5 表明 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 可能與甜櫻桃果實(shí)成熟不相關(guān) 齊希梁 劉聰利 宋露露 李 明 甜櫻桃磷酸蔗糖合酶基因 PavSPS 的功能分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1446 1456 1453 圖 5 沉默 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 的甜櫻桃果實(shí)中可溶性糖 蔗糖 葡萄糖和果糖 含量和果實(shí)硬度的變化 Fig 5 Effect of silencing of PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC in sweet cherry fruits on soluble sugar content sucrose fructose and glucose and fruit firmness 進(jìn)一步評(píng)估與果實(shí)成熟相關(guān)的一些基因的表達(dá)量變化 包括 ABA 合成與降解的關(guān)鍵基因 PavNCED1 影響果實(shí)硬度的相關(guān)基因 PavPG1 PavXYL1 和 PavPL1 影響花青素合成的相關(guān)基因 PavPAL PavCHS PavANS 和 PavDFR 圖 6 結(jié)果顯示 與對(duì)照 TRV 相比 TRV PavSPSA1 侵染的果實(shí)中 PavNCED1 PavPG1 PavXYL1 PavPL1 PavPAL PavCHS PavANS 和 PavDFR 表達(dá)量顯著下調(diào) 而 TRV PavSPSA2 TRV PavSPSB 和 TRV PavSPSC 侵染的甜櫻桃果實(shí)中上述基因的表達(dá)量與對(duì)照 TRV 相比沒(méi)有顯著差異 本研究 結(jié)果表明甜櫻桃 PavSPSA1 可能是調(diào)控果實(shí)蔗糖合成與積累的關(guān)鍵基因 影響果實(shí)著色和果實(shí)成熟 軟化 圖 6 沉默 PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB 和 PavSPSC 后的甜櫻桃果實(shí)成熟相關(guān)基因 PavNCED1 PavANS PavDFR PavCHS PavPAL PavPG1 PavXYL1 和 PavPL1 表達(dá)量的變化 Fig 6 Changes of expression levels of PavNCED1 PavANS PavDFR PavCHS PavPAL PavPG1 PavXYL1 and PavPL1 in PavSPSA1 PavSPSA2 PavSPSB and PavSPSC silencing sweet cherry fruit PaNCED1 9 cis epoxycarotenoid dioxygenase Pav sc0003135 1 g490 1 mk PavANS anthocyanidin synthase Pav sc0000107 1 g100 1 mk PavDFR dihydro flavonol 4 reductase Pav sc0002208 1 g840 1 mk PavCHS Chalcone synthase Pav sc0000045 1 g280 1 mk PavPAL phenylalanine ammonia lyase Pav co4071347 1 g010 1 mk PavPG1 polygalacturonase Pav sc0000557 1 g320 1 br PavXYL1 D xylosidase Pav sc0001014 1 g030 1 mk PavPL1 Pectate lyase 1 Pav sc0000207 1 g1250 1 mk Qi Xiliang Liu Congli Song Lulu Li Ming Functional analysis of sucrose phosphate synthase genes SPS in sweet cherry 1454 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1446 1456 3 討論 植物 SPS 基因可以分為 A B 和 C 3 個(gè)亞家族 禾本科植物還有個(gè) D 亞家族 不同亞家族 SPS 基因的表達(dá)模式和功能特性也不相同 Lutfiyya et al 2007 Sol s Guzm n et al 2017 研究表明 多數(shù)果樹(shù)中 SPS 基因家族在 庫(kù) 器官 果實(shí) 中表達(dá)量較高 且隨果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育表達(dá)豐度增加 如菠蘿 桃 梨 蘋(píng)果和柑橘等 Komatsu et al 1996 Zhang et al 2012 Vimolmangkang et al 2016 李會(huì)霞 等 2017 呂佳紅 等 2018 魏清江 等 2020 暗示了 SPS 基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程 中的重要性 根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果 推測(cè) PavSPSA1 可能是通過(guò)控制甜櫻桃果實(shí)蔗糖的濃度而影響甜 櫻桃果實(shí)成熟與軟化 Jia et al 2013 桃果實(shí)的 4 個(gè) SPS 基因家族中 PaSPS3 表達(dá)量最高 且 PaSPS3 與蔗糖和總糖含量呈正相關(guān) 表明 PaSPS3 在桃果實(shí)的蔗糖積累的過(guò)程中扮演重要作用 Vimolmangkang et al 2016 桃的 PaSPS3 ppa000639m 屬于 A 亞家族 與甜櫻桃的 PavSPSA