園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1485 1503 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0595 http www ahs ac cn 1485 收稿日期 2021 01 22 修回日期 2021 04 06 基金項(xiàng)目 高等學(xué)校創(chuàng)新基因項(xiàng)目 2021B 142 甘肅省科技重大專項(xiàng) 18ZD2NA006 甘肅省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金 項(xiàng)目 GARS SG 3 通信作者 Author for correspondence E mail maojuan 81 Tel 13659425539 草莓 LIM 家族候選基因的鑒定及在非生物脅迫 下的表達(dá) 張志強(qiáng) 盧世雄 馬宗桓 李彥彪 高彩霞 陳佰鴻 毛 娟 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 蘭州 730070 摘 要 利用 NCBI GDR 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)草莓 LIM 家族候選基因在草莓基因組水平進(jìn)行生物信息學(xué)分析 鑒定獲得 4 個(gè)亞族 37 個(gè)候選 LIM 基因 其中 9 個(gè)來(lái)自森林草莓 Fragaria vesca L 28 個(gè)來(lái)自鳳梨草莓 F ananassa Duch 草 莓 LIM 家族候選基因主要分布在細(xì)胞核 其密碼子偏好性較弱 偏向使用以 A T 結(jié)尾的同義密碼子 FvLIM 和 FaLIM 啟動(dòng)子序列上游 2 kb 區(qū)域包含大量激素及非生物脅迫響應(yīng)元件 10 PEG 200 mmol L 1 NaCl 4 低溫脅迫下 隨著處理時(shí)間延長(zhǎng) LIM 家族候選基因在鳳梨草莓 紅顏 中比森林草莓中上調(diào)趨勢(shì)更明顯 4 低溫處理下 森林草莓中以 FvLIM5 12 h 和 FvLIM7 24 h 上 調(diào)最為明顯 而鳳梨草莓 紅顏 中以 FaLIM25 12 h 和 FaLIM18 24 h 上調(diào)最為顯著 總體對(duì)低溫 響應(yīng)較明顯 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析結(jié)果表明 草莓 LIM 家族候選基因在不同組織中的表達(dá)量存在一定 差異 在根和花中的表達(dá)量偏高 綜合以上分析結(jié)果 預(yù)測(cè)草莓 LIM 家族候選基因可能在響應(yīng)非生物脅 迫以及根和花的發(fā)育中發(fā)揮重要作用 關(guān)鍵詞 草莓 LIM 家族 生物信息學(xué) qRT PCR 中圖分類號(hào) S 668 4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2021 08 1485 19 Bioinformatic Identification and Expression Analysis of Candidate Genes of LIM Protein Family in Strawberry Under Abiotic Stresses ZHANG Zhiqiang LU Shixiong MA Zonghuan LI Yanbiao GAO Caixia CHEN Baihong and MAO Juan College of Horticulture Gansu Agricultural University Lanzhou 730070 China Abstract In this paper NCBI and GDR database were used to analyze the candidate genes of LIM family in strawberry genome and 37 LIM genes could be divided into four subgroups nine LIM genes were identified from Fragaria vesca L and 28 LIM genes were identified from cultivated strawberry F ananassa Duch The LIM family candidate genes were mainly expressed in the nucleus Their codon bias were less preferred and tended to use the synonymous codon ending in A T The upstream 2 kb region of promoter sequences of FvLIM and FaLIM contained a large number of hormone response elements and abiotic stress elements The expression levels of LIM family candidate genes under 200 mmol L 1 NaCl Zhang Zhiqiang Lu Shixiong Ma Zonghuan Li Yanbiao Gao Caixia Chen Baihong Mao Juan Bioinformatic identification and expression analysis of candidate genes of LIM protein family in strawberry under abiotic stresses 1486 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1485 1503 10 PEG and 4 low temperature FaLIM were more significantly up regulated than FvLIM with the treatment time Under 4 low temperature treatment FvLIM5 12 h and FvLIM7 24 h were significantly up regulated in F vesca FaLIM25 12 h and FaLIM18 24 h significantly up regulated in F ananassa Benihoppe the overall response to low temperature is obvious The results of qRT PCR showed that most of LIM family candidate genes were highly expressed in roots and flowers their diverse and specific expression could be detected in five tissues Based on the above analysis results it was speculated that the LIM family candidate genes of strawberry might play an important role in abiotic stress and in roots and flowers development Keywords strawberry LIM gene family bioinformatics qRT PCR LIM Lin Isl Mec domain 蛋白是一類對(duì)細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程起關(guān)鍵作用的調(diào)控因子 廣泛存在于多 細(xì)胞真核生物中 并參與基因轉(zhuǎn)錄 信號(hào)傳導(dǎo) 細(xì)胞骨架建成和代謝調(diào)控等諸多方面的調(diào)節(jié) Kadrmas Beckerle 2004 劉峙 2011 Li et al 2014 LIM 蛋白擁有高度保守的 LIM 結(jié)構(gòu)域 該結(jié)構(gòu) 域由 50 60 個(gè)氨基酸構(gòu)成 Michelsen et al 1993 每個(gè)鋅指序列包括兩條反向平行的 折疊片 同時(shí) LIM 結(jié)構(gòu)域結(jié)合 2 個(gè)鋅離子 不與 DNA 結(jié)合 而是作為蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的界面 從而影響結(jié)構(gòu)蛋白 激酶 轉(zhuǎn)錄因子等多種蛋白的生物學(xué)活性 Jurata Gill 1997 Schmeichel Beckerle 1997 周建平 2006 LIM 蛋白的命名是由 2 個(gè)不同物種中的 3 個(gè)基因的首字母縮寫(xiě)而 成 分別是線蟲(chóng)的 LIN 11 和 MEC 3 及大鼠 ISL 1 Taira et al 1992 Ye et al 2013 張海燕 等 2013 可以調(diào)節(jié)不同細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的結(jié)合 而肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力受激酶 LIM 結(jié)構(gòu)域激酶 的調(diào) 節(jié) 通過(guò)肌動(dòng)蛋白解聚因子 actin depolymerization factor cofilin 的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的活性 徐陽(yáng) 等 2012 Yi et al 2017 LIM 結(jié)構(gòu)域協(xié)調(diào) 1 個(gè)或多個(gè)鋅原子 以富含半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)為特征 是 1 個(gè)鋅指串聯(lián)結(jié)構(gòu) 由 2 個(gè)不同的鋅結(jié)合亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成 一些 LIM 結(jié)構(gòu)域通過(guò)含有酪氨酸的基序與蛋白質(zhì)結(jié)合 S nchez Garc a Rabbitts 1994 Schmeichel Beckerle 1994 1997 Agulnick et al 1996 Kadrmas Beckerle 2004 Khadiza 等 2016 通過(guò)對(duì)番茄 Solanum lycopersicum L 不同器官 6 個(gè)不同發(fā)育階段的果實(shí)進(jìn)行表達(dá)譜分析 發(fā)現(xiàn) 15 個(gè) LIM 基因中有 6 個(gè)只在花中表達(dá) 其余 9 個(gè) LIM 基因在各器官和果實(shí)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá) 高雅 2019 發(fā)現(xiàn)棉花 Gossypium hirsutum GhWLIM5 和 GhXLIM6 均能夠作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白 促進(jìn)棉纖維細(xì)胞中 F actin 絲束的形成 從 而影響棉纖維的伸長(zhǎng) 楊瑞 2019 的研究表明 谷子 Setaria italica L SiWLIM2b 基因通過(guò)影響 苯丙烷次級(jí)代謝途徑 來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻抗旱性 同時(shí) SiWLIM2b 基因通過(guò)增強(qiáng)氨同化作用從而在 低氮脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用 Cheng 等 2019 將 梨 Pyrus bretschneideri 的 14 個(gè) LIM 基因分為 CRP 和 DA1 DAR LIM 2 個(gè)類群 5 個(gè)亞類 對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定和序列比對(duì) 分析 認(rèn)為 PbWLIM1a和 PbWLIM1b與木質(zhì)素代謝相關(guān) 毛娟等 2020 發(fā)現(xiàn) VvLIM1在 100 mmol L 1 NaCl 10 PEG 和 50 mg L 1 SA 脅迫下 與對(duì)照相比表達(dá)量顯著上調(diào) 且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá) 量顯著增加 大量研究報(bào)道表明 LIM 家族基因在植物響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要作用 草莓在生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)果的過(guò)程中很容易受到低溫 干旱以及鹽堿等非生物脅迫逆境的影響 有 針對(duì)性地篩選和改造相關(guān)抗逆基因 對(duì)研究草莓適應(yīng)逆境脅迫具有重要意義 從而提高和改善草莓 的產(chǎn)量和品質(zhì) Feng et al 2019 連朋 等 2019 張志強(qiáng) 盧世雄 馬宗桓 李彥彪 高彩霞 陳佰鴻 毛 娟 草莓 LIM 家族候選基因的鑒定及在非生物脅迫下的表達(dá) 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1485 1503 1487 目前 有關(guān)草莓 LIM 家族基因的鑒定克隆和功能分析仍缺乏系統(tǒng)的研究 大量的候選基因仍有 待鑒定 其表達(dá)模式和功能解析仍有待研究 本研究中利用分子生物學(xué)方法 對(duì)草莓 LIM 家族基因 進(jìn)行鑒定和表達(dá)分析 完成草莓基因組測(cè)序 https www rosaceae org species fragaria all 對(duì)其理 化性質(zhì) 基因結(jié)構(gòu)和染色體定位等進(jìn)行分析 研究草莓 LIM 家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)特點(diǎn) 為進(jìn)一步解析草莓 LIM 家族候選基因的鑒定 功能解析奠定基礎(chǔ) 同時(shí)為篩選草莓抗逆基因和遺傳 改良提供理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 材料與處理 試驗(yàn)于 2020 年在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行 非生物脅迫處理試驗(yàn)材料為鳳梨草莓品種 紅顏 Fragaria ananassa Benihoppe 和森林草莓 F vesca 在人工氣候箱 RDN 1000D 4 型 中培養(yǎng) 光照強(qiáng)度為 200 mol m 2 s 1 晝 夜光周期為 16 h 8 h 溫度 28 25 基本培養(yǎng)基為 MS 30 g L 1 蔗糖 1 0 mg L 1 6 BA 0 2 mg L 1 IAA 繼代培養(yǎng) 40 d 后選擇生長(zhǎng)健壯 長(zhǎng)勢(shì)一 致并生根的試管苗分別在 10 PEG 200 mmol L 1 NaCl 和 4 低溫條件下處理 12 和 24 h 以正 常生長(zhǎng)的試管苗作對(duì)照 每個(gè)處理設(shè)置 3 個(gè)重復(fù) 取 紅顏 草莓 來(lái)自甘肅省蘭州市西固區(qū)牟家 臺(tái)草莓種植區(qū)設(shè)施大棚 3 株混合的根 莖 葉 花和果實(shí)用于組織表達(dá)分析 重復(fù) 3 次 取樣后 經(jīng)液氮速凍 放于 80 冰箱保存 1 2 草莓 LIM 家族成員的鑒定 根據(jù)文獻(xiàn) 張海燕 等 2013 獲得玉米 Zea mays 的 LIM 基因的 ID 從 NCBI 在線數(shù)據(jù)庫(kù) https www ncbi nlm nih gov 下載每一條基因所對(duì)應(yīng)的蛋白 編碼序列 Coding sequence CDS 和基因全長(zhǎng)序列 利用獲得的 CDS 序列 在草莓基因組網(wǎng)站 https www rosaceae org species fragaria all 同源比對(duì)搜索森林草莓 FvLIM 和草莓 FaLIM 劉濤 等 2020 下載所有蛋白 CDS 和基因全長(zhǎng)序列 利用 Pfam http pfam sanger ac uk 和 SMART http smart embl heidelberg de 在線軟件進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域篩選 剔除不含有 LIM 特定結(jié)構(gòu)域 PF00412 或者結(jié)構(gòu) 域不完整的序列 為避免重復(fù)對(duì)獲得的所有序列進(jìn)行 DNAMAN 比對(duì)篩選 在草莓基因庫(kù)獲取已知 序列的氨基酸數(shù) 分子量 等電點(diǎn)等理化性質(zhì) https web expasy org protparam tdsourcetag s pcq 1 3 草莓 LIM 家族基因進(jìn)化 motif 二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析 利用 Clustalx 和 MEGA 7 0 進(jìn)行比對(duì)分析 采用鄰接法 Neighbor Joining 構(gòu)建 LIM 家族系統(tǒng) 發(fā)育樹(shù) Chenna et al 2003 利用 MEME 在線軟件 http meme suite org tools meme 進(jìn)行 motif 序列分析 Bailey et al 2009 何紅紅 等 2018 利用 https www predictprotein org 進(jìn)行 LIM 家族基因蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用 WoLF PSORT https wolfpsort hgc jp 進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析 張一菡 等 2019 利用 GSDS http gsds LIM 基因結(jié)構(gòu)進(jìn) 行分析 Zhang et al 2012 1 4 基因定位和共線性分析 密碼子使用偏好性分析和順式作用元件分析 使用在線軟件 http tools bat infspire org 對(duì)森林草莓 F v e s c a L 和鳳梨草莓 F ananassa Duch LIM 基因家族進(jìn)行共線性分析 并用 TBtools 軟件作圖 利用 CodonW 1 4 4 和 EMBOSS1 4 2 Zhang Zhiqiang Lu Shixiong Ma Zonghuan Li Yanbiao Gao Caixia Chen Baihong Mao Juan Bioinformatic identification and expression analysis of candidate genes of LIM protein family in strawberry under abiotic stresses 1488 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1485 1503 軟件獲得草莓 LIM 基因家族成員的密碼子主要參數(shù)及相對(duì)同義密碼子使用度 RSCU 值 將草莓 LIM 家族基因啟動(dòng)子上游的 2 kb 序列提交至 PlantCARE http bioinformatics psb ugent be webtools plantcare html 用于分析順式作用元件數(shù)量 并利用 HemI 繪制了啟動(dòng)子中順式作用元件 數(shù)量的熱圖 1 5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析 紅顏 草莓葉片 根 莖 花和果實(shí)中總 RNA 提取采用 CTAB 法 馬宗桓 等 2016 利 用生工生物工程 上海 股份有限公司在線進(jìn)行引物設(shè)計(jì) 表 1 并由上海生工合成 cDNA 合成用 Prime Script RT reagent Kit TaKaRa 試劑盒 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀 LightCycler 96 Real Time PCR System 進(jìn)行熒光定量 PCR 擴(kuò)增 以草莓 GAPDH 為內(nèi)參 擴(kuò)增 總體積為 25 L 含 cDNA 1 5 L 上 下游引物各 1 0 L SYBR MIX 12 5 L ddH 2 O 9 L 采用 2 CT 法 Livak Schmittgen 2001 對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算 表 1 草莓 LIM 家族候選基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物 Table 1 Real time PCR primers for strawberry LIM family candidate genes 基因 Gene 上游引物 5 3 Forward primer 下游引物 5 3 Reverse primer FvLIM1 ATATGTGGCTTGACGCAGAGACG GAGGACGCTGAGGAGGAAGAGG FvLIM2 AAACACCACCACATCCAGCTCTTC GGCTTGCTCGTTCGTTGATTGC FvLIM3 ATATGTGGCTTGACGCAGAGACG GAGGACGCTGAGGAGGAAGAGG FvLIM4 GCACCACCACACCCAACTCATC GCAACTGCTGTGGCTTTCTCATTG FvLIM5 TTGCCCAGTTGTTCAAGGAGAAGG TGCTGCGTCTGGCTTTGGTTC FvLIM6 TGCAAGGCATGTGAGAAGACTGTG AGTGGTGGCATCTGAAGCAAGC FvLIM7 GAATAGGGCACCCAGCAAACTCTC TGAGCACACCTGAAGCATGACTTG FvLIM8 TTAGACCATGCAATCGCGCTCTC GCTCGTTATCCTTCTCCTGCCATC FvLIM9 CTGGTATGTTTTCTGGCACGCAAG TGGCTCTCCACTGTCACCTTCTC FaLIM1 ATATGTGGCTTGACGCAGAGACG AAGAGGACGCTGAGGAGGAAGAC FaLIM2 GCCGAAGATTGGAGCAGATTACCG ACGAGAATTGCCGTCACTTCACAG FaLIM3 ATATGTGGCTTGACGCAGAGACG GAGGACGCTGAGGAGGAAGAGG FaLIM4 ATATGTGGCTTGACGCAGAGACG AGGACGCTGAGAAGGAAGAGGAA FaLIM5 GCACCACCACACCCAACTCATC GCAACTGCTGTGGCTTTCTCATTG FaLIM6 GATAGGACTCCACGGTGTTGTAGC TTCAAGGTAAAGGGGCTGGCATTC FaLIM7 GCTAGATGCCGAGCTTATGTCTGG GCGTGCCCTTCTTTGATGAATTGG FaLIM8 AAACACCACCACATCCAGCTCTTC GGCTTGCTCGTTCGTTGATTGC FaLIM9 TTGCCCAGTTGTTCAAGGAGAAGG TGCTGCGTCTGGCTTTGGTTG FaLIM10 TTGCCCAGTTGTTCAAGGAGAAGG TGCTGCGTCTGGCTTTGGTTC FaLIM11 CACCGCCTCTACTGTAAGCATCAC TACTCCGCCACTGTGCTCTCAG FaLIM12 TTGCCCAGTTGTTCAAGGAGAAGG TGCTGCGTCTGGCTTTGGTTC FaLIM13 TGCAAGGCATGTGAGAAGACTGTG AGTGGTGGCATCTGAAGCAAGC FaLIM14 GAATAGGGCACCCAGCAAACTCTC TGAGCACACCTGAAGCATGACTTG FaLIM15 AGTGCTTCTGTTGTCGCTCTTGTC GGATGGGCCAGCTCCTTGAAAC FaLIM16 AGGAGAAGGGGAGCTACAACCATC TGGAATGCTGGCAACTGCTACTG FaLIM17 GAATAGGGCACCCAGCAAACTCTC TGAGCACACCTGAAGCATGACTTG FaLIM18 GAATAGGGCACCCAGCAAACTCTC TGAGCACACCTGAAGCATGACTT FaLIM19 TTAGACCATGCAATCGCGCTCTC GCTCGTTATCCTTCTCCTGCCATC FaLIM20 CGACTAGGTCACCCAGCAAAGC CGACTTGTGATATGCCTGGCTCTC FaLIM21 TTAGACCATGCAATCGCGCTCTC GCTCGTTATCCTTCTCCTGCCATC FaLIM22 TCAAGGAGAAGGGGAGCTACAACC TTAGGCTTCTGGAATGCTGGCAAC FaLIM23 TCAAGGAGAAGGGGAGCTACAACC TTAGGCTTCTGGAATGCTGGCAAC FaLIM24 AGTGCTTCTGTTGTCGCTCTTGTC GGATGGGCCAGCTCCTTGAAAC FaLIM25 AAGGTCCATTTCGCTCAGCTCTTC CTTCTGGTTGTGGCTCTGCTTCTG FaLIM26 CTGGTATGTTTTCTGGCACGCAAG TGGCTCTCCACTGTCACCTTCTC FaLIM27 AGTGCTTCTGTTGTCGCTCTTGTG GGATGGGCCAGCTCCTTGAAAC FaLIM28 GAATAGGGCACCCAGCAAACTCTC TGAGCACACCTGAAGCATGACTTG GAPDH CATTCATCACCACCGACTACA GAAGGGTCTTCTCATCCTTGAC 張志強(qiáng) 盧世雄 馬宗桓 李彥彪 高彩霞 陳佰鴻 毛 娟 草莓 LIM 家族候選基因的鑒定及在非生物脅迫下的表達(dá) 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1485 1503 1489 2 結(jié)果與分析 2 1 草莓 LIM 家族候選基因理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析 從草莓基因組網(wǎng)站分別獲得了 9 條森林草莓 LIM 基因和 28 條鳳梨草莓 LIM 基因 將其分別命 名為 FvLIM1 FvLIM9 和 FaLIM1 FaLIM28 表 2 FvLIM 家族的氨基酸殘基數(shù)介于 188 538 等電點(diǎn) 5 20 FvLIM1 9 08 FvLIM9 分子量 21 205 29 60 510 36 FaLIM 家族的氨基酸殘 基數(shù)介于 176 539 等電點(diǎn)介于 5 17 9 08 分子量 19 899 54 60 571 45 FvLIM 和 FaLIM 均為 不穩(wěn)定疏水性蛋白 37 個(gè)草莓 LIM 家族成員主要定位在細(xì)胞核 表 2 表 2 草莓 LIM 家族候選基因理化性質(zhì) Table 2 Physical and chemical properties for strawberry LIM family candidate genes 名稱 Name 染色體定位 Chromosome location 氨基酸數(shù) Amino acids 分子量 Molecular weight 等電點(diǎn) pI 不穩(wěn)定指數(shù) Instability index 親水性 Hydrophilic 亞細(xì)胞定位 Subcellular localization FvLIM1 Fvb1 7945940 7952121 538 60 510 36 5 20 53 78 0 718 細(xì)胞核 Nucleus FvLIM2 Fvb2 2982770 2998244 197 22 232 22 8 89 42 90 0 703 細(xì)胞核 Nucleus FvLIM3 Fvb2 5932861 5935114 527 59 323 18 5 33 52 19 0 698 細(xì)胞核 Nucleus FvLIM4 Fvb2 24843809 24848493 191 21 205 29 9 05 29 01 0 539 細(xì)胞核 Nucleus FvLIM5 Fvb5 1235177 1237221 212 23 391 44 7 52 45 56 0 62 細(xì)胞核 Nucleus FvLIM6 Fvb5 9381785 9385122 188 21 211 15 8 86 28 77 0 586 細(xì)胞核 Nucleus FvLIM7 Fvb7 12341249 12343536 217 23 962 13 6 50 45 65 0 567 細(xì)胞核 Nucleus FvLIM8 Fvb7 18342947 18346948 504 57 014 81 8 26 52 67 0 541 細(xì)胞核 Nucleus FvLIM9 Fvb7 18517083 18519868 200 21 721 91 9 08 37 48 0 362 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM1 Fvb1 1 20431547 20437334 534 59 915 92 5 22 52 12 0 668 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM2 Fvb1 2 9164763 9171264 533 60 168 24 5 39 51 21 0 737 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM3 Fvb1 3 8145568 8151824 539 60 522 40 5 20 54 39 0 719 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM4 Fvb1 4 6945308 6951056 538 60 571 45 5 17 53 06 0 712 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM5 Fvb2 2 728488 730564 191 21 205 29 9 05 29 01 0 539 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM6 Fvb2 2 18290991 18293017 231 27 087 33 7 80 45 08 0 512 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM7 Fvb2 3 2848239 2854332 491 55 136 60 5 75 44 43 0 671 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM8 Fvb2 4 1747334 1750087 176 19 899 54 8 83 44 58 0 618 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM9 Fvb5 1 1118664 1120389 213 23 551 67 7 92 45 67 0 623 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM10 Fvb5 2 1037693 1039462 216 23 835 04 8 18 44 28 0 569 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM11 Fvb5 3 18813760 18816438 188 21 172 07 8 86 31 15 0 599 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM12 Fvb5 4 1027068 1028886 211 23 297 40 7 52 43 54 0 607 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM13 Fvb5 4 7252377 7255038 188 21 199 10 8 86 29 68 0 613 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM14 Fvb7 1 16915680 16917768 217 23 964 10 6 50 45 95 0 579 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM15 Fvb7 1 25526059 25530050 506 57 362 23 8 54 52 15 0 549 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM16 Fvb7 1 25665993 25670535 200 21 818 02 9 08 37 58 0 360 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM17 Fvb7 2 11429297 11431530 217 23 962 13 6 50 45 65 0 567 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM18 Fvb7 2 17869656 17871925 217 23 949 13 6 50 45 65 0 554 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM19 Fvb7 2 23292270 23296225 493 55 877 59 8 37 53 86 0 540 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM20 Fvb7 2 23449921 23452679 200 21 691 82 9 08 37 63 0 376 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM21 Fvb7 2 23655808 23659719 430 49 337 54 8 63 48 07 0 525 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM22 Fvb7 2 23849991 23852934 200 21 721 91 9 08 37 48 0 362 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM23 Fvb7 3 5169640 5172605 200 21 704 86 9 01 38 00 0 353 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM24 Fvb7 3 6773453 6777457 506 57 325 21 8 45 52 87 0 541 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM25 Fvb7 3 12069028 12071004 215 23 793 94 6 50 44 19 0 573 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM26 Fvb7 4 5056752 5059611 200 21 721 91 9 08 37 48 0 362 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM27 Fvb7 4 5292185 5296170 506 57 277 11 8 45 51 10 0 545 細(xì)胞核 Nucleus FaLIM28 Fvb7 4 11548941 11551124 214 23 743 92 6 54 42 18 0 534 細(xì)胞核 Nucleus 2 2 草莓 LIM 家族候選基因多序列比對(duì)及進(jìn)化分析 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 圖 1 將草莓 LIM 基因家族分為 DA1 DAR 14 個(gè)成員 和 CRP 24 個(gè)成員 Zhang Zhiqiang Lu Shixiong Ma Zonghuan Li Yanbiao Gao Caixia Chen Baihong Mao Juan Bioinformatic identification and expression analysis of candidate genes of LIM protein family in strawberry under abiotic stresses 1490 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1485 1503 亞族 而 CRP 又可分為 PWLIM2 WLIM2 和 WLIM1 亞族 其中 CRP 亞族成員均含有 2 個(gè) LIM 結(jié) 構(gòu)域 而 DA1 DAR 亞族成員含有 1 個(gè) LIM 結(jié)構(gòu)域 LIM 家族基因呈現(xiàn)明顯的聚類現(xiàn)象 其中草 莓 LIM 家族成員與蘋(píng)果和番茄的進(jìn)化關(guān)系更近 圖 1 草莓 LIM 家族候選基因進(jìn)化樹(shù) Fa 鳳梨草莓 Fv 森林草莓 Md 蘋(píng)果 At 擬南芥 Sl 番茄 Zm 玉米 Os 水稻 Fig 1 The phylogenetic tree for strawberry LIM family candidate genes Fa Fragaria ananassa Fv Fragaria vesca Md Malus domestica At Arabidopsis thaliana Sl Solanum lycopersicum Zm Zea mays Os Oryza sativa 對(duì)草莓 LIM 家族基因氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì) 主要有兩種序列 FvLIM1 等 14 個(gè)成員只含有 1 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)序列 其結(jié)構(gòu)為 C X2 C X20 C 圖 2 A FvLIM2 等 23 個(gè)成員均含有 2 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu) 的序列 其結(jié)構(gòu)為 C X2 C X20 C X2 C X2 C X72 C X2 C X20 C 圖 2 B LIM 蛋白具有較 長(zhǎng)的 C 末端結(jié)構(gòu)域 其中 DA1 DAR 亞族成員在 C 端高度保守 只保留了 N 端的結(jié)構(gòu)域 2 3 草莓 LIM 家族基因結(jié)構(gòu)分析 同一亞族外顯子分布和數(shù)量基本相同和相似 不同亞族則不同 FvLIM3 和 FaLIM6 不含基因上 游結(jié)構(gòu) 其他基因結(jié)構(gòu)完整 而其他 35 個(gè)成員均含有基因上 下游結(jié)構(gòu) CRP 亞族成員外顯子數(shù)均 為 5 個(gè) 除 FaLIM8 4 個(gè) DA1 DAR 亞族外顯子數(shù)介于 10 12 除 FvLIM3 5 個(gè) 和 FaLIM6 6 個(gè) 該家族大部分成員的外顯子數(shù)和內(nèi)含子數(shù)相同 圖 3 推測(cè)這些基因在功能上有一定的 相似性 同一亞族之間外顯子長(zhǎng)度存在差異 保守性差 張志強(qiáng) 盧世雄 馬宗桓 李彥彪 高彩霞 陳佰鴻 毛 娟 草莓 LIM 家族候選基因的鑒定及在非生物脅迫下的表達(dá) 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1485 1503 1491 圖 2 草莓 LIM 蛋白多序列比對(duì) Fig 2 The multiple sequence alignment of LIM protein in strawberry Zhang Zhiqiang Lu Shixiong Ma Zonghuan Li Yanbiao Gao Caixia Chen Baihong Mao Juan Bioinformatic identification and expression analysis of candidate genes of LIM protein family in strawberry under abiotic stresses 1492 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1485 1503 圖 3 草莓 LIM 家族基因結(jié)構(gòu)分析 Fig 3 The gene structure analysis for strawberry LIM family 2 4 草莓 LIM 家族候選基因 motif 序列分析 對(duì)森林草莓和鳳梨草莓 LIM 家族 37 個(gè)成員進(jìn)行保守基序預(yù)測(cè) 共得到 8 個(gè)基序 表 3 其 中 motif1 motif5 motif7 均含有 50 個(gè)氨基酸殘基 motif6 和 motif8 所含氨基酸殘基最少 均為 21 個(gè) 由圖 4 可知 有 4 個(gè) LIM 成員含有 3 個(gè) motif 最多含有 6 個(gè) 其中 motif1 和 motif6 出現(xiàn)頻率 最高 猜測(cè)其在 FvLIM 和 FaLIM 蛋白功能方面發(fā)揮重要作用 DA1 DAR 亞族的大部分成員包含 motif2 和 motif8 CRP 亞族大部分成員含有 motif3 motif4 motif5 和 motif7 說(shuō)明這些成員執(zhí)行的 功能相似 表 3 草莓 LIM 家族候選基因氨基酸保守序列 Table 3 Conserved motifs for strawberry LIM family candidate gen