園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1437 1445 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0668 http www ahs ac cn 1437 收稿日期 2021 02 23 修回日期 2021 06 07 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 31701893 32072517 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2018YFD1000105 河南省高?？萍紕?chuàng)新人才項(xiàng) 目 21HASTIT035 河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目 No 81 河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目 21IRTSTHN021 洛 陽(yáng)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 2101102A 通信作者 Author for correspondence E mail yuyihe 巨峰 葡萄細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 VlRR5 的克隆與表達(dá)分析 邊 璐 郭大龍 于可可 韋同路 裴茂松 劉海楠 余義和 河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院 河南洛陽(yáng) 471023 摘 要 葡萄在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn) 3 次落果高峰 巨峰 葡萄的落果現(xiàn)象更為嚴(yán)重 從 巨 峰 葡萄中克隆得到 1 個(gè)細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 VlRR5 該基因有 1 個(gè)磷酸受體結(jié)構(gòu)域 REC 和 1 個(gè) MYB 樣 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 cDNA 全長(zhǎng) 2 597 bp 編碼 693 個(gè)氨基酸 定位在 4 號(hào)染色體上 亞細(xì)胞定位 在細(xì)胞核中 酵母轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中 轉(zhuǎn)入 pGBKT7 VlRR5 的酵母菌可以在 SD Trp Ade His X Gal 缺陷型 培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)且顯藍(lán)色 證明 VlRR5 具有轉(zhuǎn)錄激活活性 熒光定量 PCR 分析顯示 VlRR5 的表達(dá)具 有組織特異性 在葉和莖中表達(dá)量較高 在幼果發(fā)育階段呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì) 并且在外源細(xì)胞分 裂素 CPPU 處理后表達(dá)量上升 在細(xì)胞分裂素合成抑制劑洛伐他汀處理后表達(dá)量下降 這些結(jié)果表明 VlRR5 可以響應(yīng)外源細(xì)胞分裂素處理 在細(xì)胞分裂素介導(dǎo)葡萄坐果過(guò)程中發(fā)揮重要作用 關(guān)鍵詞 葡萄 細(xì)胞分裂素 CPPU 細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 VlRR5 中圖分類號(hào) S 663 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2021 08 1437 09 Cloning and Expression Analysis of the Cytokinin Response Regulator VlRR5 in Kyoho Grapevine BIAN Lu GUO Dalong YU Keke WEI Tonglu PEI Maosong LIU Hainan and YU Yihe College of Horticulture and Plant Protection Henan University of Science and Technology Luoyang Henan 471023 China Abstract There are three fruit dropping peaks in grape growth and development Grape fruit dropping phenomenon is more serious in Kyoho grapevine In this study a cytokinin response regulator VlRR5 was cloned from Kyoho grapevine which has a phosphoric acid receptor domain REC and a MYB like DNA binding domain Sequence analysis revealed that cDNA of VlRR5 was 2 597 bp in length encoding 693 amino acids and located on chromosome 4 of grape Subcellular localization assay showed that VlRR5 was localized in the nucleus The yeast transformed into pGBKT7 VlRR5 could grow normally and turn blue on SD Trp Ade His X Gal deficient medium which proved that VlRR5 was a transcription factor with transcriptional activation activity By quantitative real time PCR analysis VlRR5 was characterized by tissue specific expression and showed high expression level in leaf and stem which was Bian Lu Guo Dalong Yu Keke Wei Tonglu Pei Maosong Liu Hainan Yu Yihe Cloning and expression analysis of the cytokinin response regulator VlRR5 in Kyoho grapevine 1438 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1437 1445 increased and then decreased in the development stage of young fruit The expression level increased after treatment with exogenous cytokinin and decreased after treatment with the cytokinin synthesis inhibitor lovastatin These results indicated that VlRR5 can respond to cytokinin and plays an important role in participating in cytokinin to improve the fruiting rate of grape Keywords grapevine cytokinin CPPU cytokinin response regulators VlRR5 葡萄 Vitis vinifera L 作為世界性第二大水果被廣泛地種植和加工利用 為人類創(chuàng)造了明顯的 經(jīng)濟(jì) 生態(tài)和社會(huì)效益 Yu et al 2019a 鮮食葡萄中以巨峰系葡萄栽培面積最為廣泛 巨峰系葡 萄品種存在較嚴(yán)重的落花落果現(xiàn)象 尤其是盛花后 8 9 d 為第 1 次生理落果期 有些植株落果率高 達(dá) 50 CPPU N 2 chloro 4 pyridyl N phenylurea 是一種細(xì)胞分裂素類的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 具有顯 著促進(jìn)植物根 莖 葉生長(zhǎng)的作用 CPPU 不僅能促進(jìn)葡萄等果實(shí)膨大 提高其產(chǎn)量 也有促進(jìn)坐 果的作用 并且可以促進(jìn)果實(shí)早熟 樊彪和趙江哲 2017 植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素主要是通過(guò)一種類似于細(xì)菌中雙元組分系統(tǒng)的途徑將信號(hào)傳遞至下游元 件的 梁朋 等 2002 主要分為 3 個(gè)部分 首先是細(xì)胞分裂素受體組氨酸激酶 histidine kinase HK 與細(xì)胞分裂素結(jié)合后自磷酸化 并將磷酸基團(tuán)由激酶區(qū)的組氨酸轉(zhuǎn)移至信號(hào)接收區(qū)的天冬氨酸 接著天冬氨酸上的磷酸基團(tuán)被傳遞到胞質(zhì)中的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 histidine phosphotransfer protein HP 上 磷酸化的 HP 進(jìn)入細(xì)胞核并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到 A 型和 B 型反應(yīng)調(diào)節(jié)因子 response regulator RR 上 進(jìn)而調(diào)節(jié)下游的細(xì)胞分裂素 Sheen 2002 Schaller et al 2011 Ramireddy et al 2013 RR 是細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中能夠參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移進(jìn)而調(diào)節(jié)下游細(xì)胞分裂素反應(yīng)基因表達(dá) 的關(guān)鍵基因 RR 在參與植物生長(zhǎng)發(fā)育 晝夜節(jié)律等發(fā)揮重要作用 在擬南芥中 A 型 ARR7 和 ARR15 與生長(zhǎng)素信號(hào)相互作用 在干細(xì)胞特化過(guò)程中起重要作用 Hua et al 2012 ARR4 參與調(diào)節(jié)擬南 芥的晝夜節(jié)律 直接調(diào)節(jié) phyB 的活性狀態(tài) 正向調(diào)節(jié)紅光信號(hào) Salom et al 2005 最近有研究 表明 擬南芥中 ARR16 通過(guò)抑制細(xì)胞分裂素信號(hào)來(lái)控制雌蕊的生長(zhǎng) Reyes Olalde et al 2017 在 水稻中 獨(dú)腳金內(nèi)酯突變體中細(xì)胞分裂素含量明顯升高 編碼細(xì)胞分裂素氧化酶基因 OsCKX9 的表 達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞分裂素降解 通過(guò) 1 個(gè) A 型細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子 OsRR5 調(diào)控幼苗的分蘗 株高和穗 大小 Duan et al 2019 除此之外 RR 在植物非生物脅迫中也起重要作用 在擬南芥中 EIN3 通 過(guò)直接與啟動(dòng)子中的特異區(qū)域來(lái)負(fù)調(diào)控冷相關(guān)基因 CBF 和 A 型 ARR5 ARR7 ARR15 過(guò)表達(dá)這些 ARR 基因會(huì)增強(qiáng)植物的耐寒性 這些結(jié)果說(shuō)明乙烯對(duì)冷信號(hào)的負(fù)調(diào)控至少部分是通過(guò) EIN3 對(duì)冷調(diào) 控的 CBF 和 A 型 ARR 基因的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控實(shí)現(xiàn)的 Huang et al 2018 前期對(duì) 巨峰 葡萄花序進(jìn)行 CPPU 處理 在果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期采樣然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期處理與對(duì)照之間的差異基因中包括很多被注釋為雙元信號(hào)感受器 two component response regulator 的基因 本研究中 克隆了該家族中的 1 個(gè)成員 VlRR5 VIT 04s0008g05900 t01 通過(guò)熒光定量測(cè)定該基因在 巨峰 葡萄不同組織 不同發(fā)育時(shí)期幼果的表達(dá) 情況 通過(guò)亞細(xì)胞定位和酵母單雜交試驗(yàn)明確 VlRR5 是否是 1 個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子 初 步分析 VlRR5 的表達(dá)特異性和參與響應(yīng)細(xì)胞分裂素調(diào)控葡萄幼果發(fā)育的作用 這些研究一方面可為 研究細(xì)胞分裂素影響葡萄坐果的分子機(jī)制打下基礎(chǔ) 也為其他果實(shí)坐果分子機(jī)制提供理論參考 另 一方面為生產(chǎn)中合理使用 CPPU 提供理論依據(jù) 邊 璐 郭大龍 于可可 韋同路 裴茂松 劉海楠 余義和 巨峰 葡萄細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 VlRR5 的克隆與表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1437 1445 1439 1 材料與方法 1 1 植物材料及其處理 以河南省洛陽(yáng)市偃師市葡萄栽培基地 東經(jīng) 112 79 北緯 34 73 海拔 135 m 的 巨峰 葡 萄作為試驗(yàn)材料 分別用 10 mg L 1 CPPU 加 Silwet 77 表面活性劑 終濃度 0 03 體積比 和 40 mmol L 1 細(xì)胞分裂素合成抑制劑洛伐他汀 Lov 做浸蘸花序處理 以清水加 Silwet 77 表面活 性劑 終濃度 0 03 處理為對(duì)照 處理時(shí)間為盛花后 5 d 2018 年 5 月 25 日 浸蘸 10 s 于 2018 年 5 月 25 26 27 29 日和 6 月 2 日采樣 并于 2018 年 5 月對(duì)葡萄不同組織 根 莖 葉 花序 卷須 進(jìn)行采樣 采樣后迅速置于液氮速凍 后在 80 超低溫冰箱保存?zhèn)溆?1 2 RNA 的提取和熒光定量試驗(yàn) 使用 RNA prep 純植物試劑盒 天根 北京 中國(guó) 提取總 RNA 總 RNA 用 RNase free DNase 處理 TaKaRa 去除基因組的 DNA 污染 用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 合成 cDNA 第 1 鏈 用 SMARTer TM RACE cDNA Amplification Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 使用 SYBR Premix Ex Taq TaKaRa 和基因特異引物 表 1 在 Bio Rad IQ5 Real Time PCR 檢測(cè)系統(tǒng) Bio Rad Laboratories Hercules CA USA 進(jìn)行 qRT PCR Yu et al 2019b 1 3 基因克隆及載體構(gòu)建 以 巨峰 葡萄總 RNA 反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 產(chǎn)物為模板 用 VlRR5 特異引物 表 1 進(jìn)行 PCR 將 PCR 產(chǎn)物在 1 的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳 觀察條帶位置正確后在特異引物上添加同源接頭合成 新的引物 表 1 用新合成的引物再次進(jìn)行 PCR 將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳 用膠回收試劑盒切 膠回收 對(duì)亞細(xì)胞定位載體 酵母單雜交載體 用限制性核酸內(nèi)切酶酶切 用同源重組試劑盒把線 性化載體和膠回收產(chǎn)物進(jìn)行同源重組 進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化 挑選陽(yáng)性克隆搖菌 菌液 PCR 檢測(cè) 表 1 引物列表 Table 1 List of primers 引物名稱基因 Primer 堿基序列 5 3 Primer sequence QT VlRR5 F TGGGTATGCATTGCCTTTCT R GAAGAAGGAAGCTCTGCGTTT VlRR5 F ATGACAGTTGAACCGAGGGT R TTAATGGAAAAGAACTTGAT Y1H RR5 F ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGACAGTTGAACCGAGGGT R ATGCGGCCGCTGCAGGAATTCTTAATGGAAAAGAACTTGAT LS RR5 F AGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGACAGTTGAACCGAGGGT R CTTCTCCCTTACCCATGGTACCTTAATGGAAAAGAACTTGAT 1 4 VlRR5 的生物信息分析 在 Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載 VlRR5 序列 將 VlRR5 蛋白質(zhì)序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 Blast 用 ClustalX 對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì) 用 MEGA7 做系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 用 ExPASy 網(wǎng)站 https web expasy org cgi bin compute pi pi tool 分析氨基酸序列 蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn) 用 ExPASy 網(wǎng)站上 的 PROSITE https prosite expasy org 預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域 用在線網(wǎng)站 PlantCARE http bioinformatics psb ugent be webtools plantcare html 預(yù)測(cè) VlRR5 的順式作用元件 Bian Lu Guo Dalong Yu Keke Wei Tonglu Pei Maosong Liu Hainan Yu Yihe Cloning and expression analysis of the cytokinin response regulator VlRR5 in Kyoho grapevine 1440 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1437 1445 1 5 亞細(xì)胞定位 將 pBI121 VlRR5 GFP 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中 以 pBI121 GFP 作為陰性對(duì)照 挑選陽(yáng)性克隆搖菌 大量抽提質(zhì)粒 純化質(zhì)粒 包埋金粉 點(diǎn)于微粒載膜中央 用基因槍對(duì)洋蔥表皮進(jìn)行轉(zhuǎn)化 在高滲 培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜 轉(zhuǎn)至等滲培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h 在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光 1 6 酵母單雜交 將 pGBKT7 空載體 陰性對(duì)照 以 pGBKT7 GAL4 陽(yáng)性對(duì)照 pGBKT7 VlRR5 分別轉(zhuǎn)化至 AH109 酵母菌株中 分別涂布在 SD Trp SD Trp Ade His SD Trp Ade His X Gal 缺陷型培 養(yǎng)基上 避光放置在 30 恒溫培養(yǎng)箱中 2 3 d 觀察酵母菌生長(zhǎng)情況 2 結(jié)果與分析 2 1 VlRR5 的克隆及其生物信息 從 EnsmblPlants 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載 VlRR5 的序列 設(shè)計(jì)特異引物 以從 巨峰 葡萄幼果中提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄成的 cDNA 為模板 通過(guò) PCR 擴(kuò)增得到 VlRR5 全長(zhǎng)序列 序列分析發(fā)現(xiàn) VlRR5 全長(zhǎng) 2 597 bp 編碼 693 個(gè)氨基酸 蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為 5 97 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在 VlRR5 的 19 134 位具 有 1 個(gè)磷酸接收結(jié)構(gòu)域 REC 在 201 260 位具有 1 個(gè) MYB 樣的 DNA 結(jié)合域 將 VlRR5 與擬 南芥 水稻 蘋(píng)果等物種的 RR 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行比對(duì) 圖 1 進(jìn)一步確定 圖 1 VlRR5 和其他物種 RR 氨基酸序列比對(duì) A 磷酸接收結(jié)構(gòu)域 REC B MYB 樣 DNA 結(jié)合域 Pan 糙葉山麻黃 Md 蘋(píng)果 Os 水稻 At 擬南芥 Fig 1 Amino acid sequence alignment of VlRR5 and other species RRs A Phosphoric acid receptor domain REC B MYB like DNA binding domain Pan Parasponia andersonii Md Malus domestica Os Oryza sativa At Arabidopsis thaliana 對(duì) VlRR5 啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件分析 結(jié)果 表 2 顯示 VlRR5 的啟動(dòng)子區(qū)含有光響應(yīng) 生 長(zhǎng)素 脫落酸 茉莉酸和水楊酸響應(yīng)元件 將 VlRR5 與 Blast 得到的同源序列進(jìn)行比對(duì) 利用 MEGA 制作進(jìn)化樹(shù) 圖 2 VlRR5 與擬南 芥 ARR12 At2g25180 1 同源性為 81 與藍(lán)果樹(shù) NsRR5 F0562 007419 1 同源性為 55 通過(guò) STRING 分析可以發(fā)現(xiàn) VlRR5 與葡萄中 10 個(gè)蛋白互作關(guān)系較高 其中 VIT 06s0080g00060 VIT 14s0030g00410 VIT 04s0008g00210 VIT 05s0020g02210 VIT 07s0104g00880 VIT 09s0002 g03520 VIT 13s0074g00740 VIT 09s0002g06960 均被 GO 注釋為具有組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移激酶活性 結(jié)合組氨 邊 璐 郭大龍 于可可 韋同路 裴茂松 劉海楠 余義和 巨峰 葡萄細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 VlRR5 的克隆與表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1437 1445 1441 酸激酶 參與細(xì)胞分裂素激活信號(hào)途徑 磷酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) VIT 14s0030g02200 被注釋為與激酶 結(jié)合 具有蛋白質(zhì)異二聚活性 參與細(xì)胞對(duì)葡萄糖 脫落酸和饑餓的響應(yīng) 以及對(duì)晝夜節(jié)律的響應(yīng) 而 VIT 03s0091g00290 被注釋為具有 DNA 結(jié)合能力和金屬離子結(jié)合能力 表 2 VlRR5 啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件 Table 2 The cis acting elements in promoters of VlRR5 順式作用元件 cis acting element 功能 Function 序列 Sequence 數(shù)量 Amount gGTAAAGAAA 脫落酸響應(yīng) Abscisic acid responsiveness ACGTG 1 ARE 厭氧誘導(dǎo) Anaerobic induction AAACCA 3 AuxRR core 生長(zhǎng)素響應(yīng) Auxin responsiveness GGTCCAT 1 CAT box 分生組織表達(dá) Meristem expression GCCACT 1 CGTCA motif 茉莉酸甲酯響應(yīng) MeJA responsiveness CGTCA 2 G box 光響應(yīng) Light responsiveness TACGTG 2 MBS 參與干旱誘導(dǎo)的 MYB 結(jié)合位點(diǎn) MYB binding site involved in drought inducibility CAACTG 9 Pc CMA2a 光響應(yīng)元件的一部分 Part of a light responsive element CAGCCAATCACAG 1 TATA box 在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始 30 左右的核心啟動(dòng)子元件 Core promoter element around 30 of transcription start TATA 5 TCA element 水楊酸響應(yīng) Salicylic acid responsiveness TCAGAAGAGG 1 TGACG motif 茉莉酸甲酯響應(yīng) MeJA responsiveness TGACG 2 CAAT box 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域的順式作用元件 Common cis acting element in promoter and enhancer regions CAAAT 49 圖 2 VlRR5 與其他物種 RR 蛋白質(zhì)的進(jìn)化樹(shù)分析 St 馬鈴薯 Sl 番茄 Os 水稻 Tt 唐松草小銀蓮花 Nn 蓮 At 擬南芥 Ns 藍(lán)果樹(shù) Ac 中華獼猴桃 Cs 茶 Cm 香瓜 Cf 川黔千金榆 Pan 山黃麻 Zj 棗 Md 蘋(píng)果 Pd 扁桃 Pa 歐洲甜櫻桃 Fig 2 Phylogenetic tree of VlRR5 and RR proteins of other species St Solanum tuberosum Sl Solanum lycopersicum Os Oryza sativa subsp japonica Tt Thalictrum thalictroides Nn Nelumbo nucifera At Arabidopsis thaliana Ns Nyssa sinensis Ac Actinidia chinensis var chinensis Cs Camellia sinensis Cm Cucumis melo Cf Carpinus fangiana Pan Parasponia andersonii Zj Ziziphus jujuba Md Malus domestica Pd Prunus dulcis Pa Prunus avium 2 2 VlRR5 亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性分析 構(gòu)建 pBI121 VlRR5 GFP 亞細(xì)胞定位重組質(zhì)粒 用基因槍法將其瞬時(shí)表達(dá)于洋蔥表皮 在激光 共聚焦顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn) VlRR5 定位在細(xì)胞核中 圖 3 Bian Lu Guo Dalong Yu Keke Wei Tonglu Pei Maosong Liu Hainan Yu Yihe Cloning and expression analysis of the cytokinin response regulator VlRR5 in Kyoho grapevine 1442 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1437 1445 圖 3 VlRR5 的亞細(xì)胞定位 Fig 3 Analysis of the localization of the VlRR5 protein 為了解 VlRR5 在參與細(xì)胞分裂素調(diào)控葡萄坐果中是否發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用 VlRR5 連接到 pGBKT7 載體轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞 結(jié)果 圖 4 顯示轉(zhuǎn)入 pGBKT7 VlRR5 pGBKT7 GAL4 以及 pGBKT7 空載體的酵母菌可以在 SD Trp 培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 轉(zhuǎn)入 pGBKT7 VlRR5 pGBKT7 GAL4 的酵母菌可 以在 SD Trp His Ade 缺陷型培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng) 而轉(zhuǎn)入 pGBKT7 空載體的酵母菌不能在此缺陷型 培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 同樣的 轉(zhuǎn)入 pGBKT7 VlRR5 pGBKT7 GAL4 的酵母菌可以在 SD Trp His Ade X Gal 缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)且顯藍(lán)色 而轉(zhuǎn)入 pGBKT7 空載體的酵母菌不能在 SD Trp His Ade X Gal 缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 2 3 VlRR5 的表達(dá)特性及其對(duì)外源細(xì)胞分裂素 CPPU 的響應(yīng) 熒光定量 PCR 結(jié)果 圖 5 顯示 VlRR5 在葡萄葉片中表達(dá)量最高 其次是莖 而在花序和果 實(shí)中的表達(dá)量較低 用 CPPU 對(duì)葡萄花序處理 從表型 圖 6 A 可以明顯看出對(duì)照在處理后 4 和 8 d 落果嚴(yán)重 而 CPPU 處理后落果較少 處理后 1 d VlRR5 的表達(dá)量與對(duì)照相比無(wú)差異 處理 后 2 和 4 d 顯著高于對(duì)照 總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì) 4 d 時(shí)達(dá)到峰值 圖 6 B 圖 4 VlRR5 的轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè) Fig 4 Transcriptional activation assay of the VlRR5 圖 5 VlRR5 的表達(dá)特異性分析 Fig 5 Diverse expression patterns of VlRR5 邊 璐 郭大龍 于可可 韋同路 裴茂松 劉海楠 余義和 巨峰 葡萄細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 VlRR5 的克隆與表達(dá)分析 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 8 1437 1445 1443 圖 6 CPPU 處理后葡萄表型 A 及 VlRR5 表達(dá)水平 B Fig 6 Grape phenotype A and VlRR5 expression level B after CPPU treatment 0 05 為進(jìn)一步確認(rèn) VlRR5 受細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)影響葡萄坐果 用細(xì)胞分裂素合成抑制劑 Lov 對(duì)葡萄花 序進(jìn)行處理 與對(duì)照相比在處理后 4 8 d 落果嚴(yán)重 果穗松散 圖 7 A 在 Lov 處理后 1 2 8 d VlRR5 的表達(dá)量與對(duì)照相比無(wú)差異 處理后 4 d 顯著低于對(duì)照 圖 7 B 圖 7 細(xì)胞分裂素合成抑制劑 Lov 處理后葡萄表型 A 及 VlRR5 的表達(dá)水平 B Fig 7 Grape phenotype A and VlRR5 expression level B after inhibitors of cytokinin synthesis Lov treatment 0 05 3 討論 細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子是細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子 姚繼芳 等 2019 雖然生產(chǎn) 上細(xì)胞分裂素已經(jīng)廣泛用于提高葡萄的坐果率 但是細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子在其中發(fā)揮的作用尚不明 確 在擬南芥中 細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子可以分為 3 類 A 型 ARR B 型 ARR 以及由 ARR22 和 ARR24 組成的第 3 類 B 型 ARR 除了具有信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域外 還具有 1 個(gè)長(zhǎng)長(zhǎng)的 C 末端 包含 1 個(gè) MYB 樣 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 GARP 結(jié)構(gòu)域 A 型 ARR 具有 1 個(gè)信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域和一小段的 N Bian Lu Guo Dalong Yu Keke Wei Tonglu Pei Maosong Liu Hainan Yu Yihe Cloning and expression analysis of the cytokinin response regulator VlRR5 in Kyoho grapevine 1444 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1437 1445 末端和 C 末端 缺少 DNA 結(jié)合域 Wallmeroth et al 2019 本研究中在 巨峰 葡萄中克隆得到 1 個(gè)細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子 VlRR5 結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn) VlRR5 具有 1 個(gè)磷酸接收結(jié)構(gòu)域 REC 和 1 個(gè) MYB 樣的 DNA 結(jié)合域 這表明 VlRR5 是 1 個(gè) B 型 RR 基因 VlRR5 定位于細(xì)胞核 且具有轉(zhuǎn)錄激活活性 說(shuō)明 VlRR5 是 1 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 這與前人研究成果是 一致的 在擬南芥中 B 型 ARR 基因缺失或者 A 型 ARR 基因過(guò)表達(dá)的植株表現(xiàn)出和細(xì)胞分裂素受體 功能缺失突變體相似的表型 表明 B 型 ARRs 是一類轉(zhuǎn)錄因子 為細(xì)胞分裂素的正調(diào)控因子 Nguyen et al 2016 這暗示了 VlRR5 作為 1 個(gè) B 型 RR 轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)細(xì)胞分裂素過(guò)程中起正調(diào)控作用 VlRR5 在葡萄莖中表達(dá)量較多 而在小麥中 TaARR1 主要在根和葉中表達(dá) Yang et al 2019 PtRR 和 PtRR10 12d 在楊樹(shù)根部 形成層 木質(zhì)部表達(dá)量相對(duì)較高 在草莓中 B 型 FvRR8 FvRR9 FvRR10 和 FvRR13 均有組織特異性表達(dá) 并且在草莓的根 匍匐莖中表達(dá)較多 Yang et al 2016 這證明 VlRR5 與其他物種中的 RR 轉(zhuǎn)錄因子一樣具有組織特異性 在受到外源細(xì)胞分裂素處理后 VlRR5 的表達(dá)被迅速誘導(dǎo) 且在處理后 2 4 d 與對(duì)照顯著差異 B 型 RR 基因表現(xiàn)出對(duì)外源細(xì)胞分裂素的響應(yīng) 如在蘋(píng)果中 6 BA 處理后 B 型 MdRRB2 3 MdRRB11 MdRRB5 MdRRB10 基因的表達(dá)量受到誘導(dǎo) Li et al 2017 在梨中 CPPU 處理后 B 型 PpRR3 PpRR6 PpRR7 PpRR8 的表達(dá)量均上調(diào) 并且隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì) Ni et al 2017 以上結(jié)果表明 VlRR5 同其他 B 型 RR 轉(zhuǎn)錄因子一樣會(huì)受到細(xì)胞分裂素誘導(dǎo) 同時(shí) VlRR5 的表達(dá)量在細(xì)胞分裂素合成抑制劑 Lov 處理后 4 d 顯著低于對(duì)照 從側(cè)面進(jìn)一步證明了這一結(jié)果 CPPU 處理后 4 d 開(kāi)始 對(duì)照組落果嚴(yán)重 在細(xì)胞分裂素合成抑制劑 Lov 處理后 4 d 開(kāi)始 落果更為 嚴(yán)重 說(shuō)明處理后 4 d 盛花后 9 d 是 VlRR5 響應(yīng)細(xì)胞分裂素提高葡萄坐果率的關(guān)鍵時(shí)期 References Duan J Yu H Yu an K Liao Z Meng X Jing Y Liu G Chu J Li J 2019 Strigolactone promotes cytokinin degradation through transcriptional activation of CYTOKININ OXIDASE DEHYDROGENASE 9 in rice Proceedings of the National Academy of Sciences 116 28 14319 14324 Fan Biao Zhao Jiangzhe 2017 Research progress of cytokinin and its application in crop production Zhejiang Agricultural Sciences 58 8 1411 1414 in Chinese 樊 彪 趙江哲 2017 細(xì)胞分裂素研究進(jìn)展及其在作物生產(chǎn)中的應(yīng)用 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 58 8 1411 1414 Hua D Wang C He J Liao H Duan Y Zhu Z Guo Y Chen Z Gong Z 2012 A plasma membrane receptor kinase GHR1 mediates abscisic acid and hydrogen peroxide regulated stomatal movement in Arabidopsis The Plant Cell 24 6 2546 2561 Huang X Hou L Meng J You H Li Z Gong Z Yang S Shi Y 2018 The antagonistic action of abscisic acid and cytokinin signaling mediates drought stress response in Arabidopsis Molecular Plant 11 7 970 982 Li Y Zhang D Zhang L Zuo X Fan S Zhang X Shalmani A Han M 2017 Identification and expression analysis of cytokinin response regulator 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