收稿日期 2020 12 24 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 2017YFD0101904 作者簡(jiǎn)介 劉開(kāi) 1994 女 在讀碩士生 研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與生物技術(shù) E mail 1603591859 通信作者 曹必好 1970 男 博士 教授 研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與生物技術(shù) E mail caobh01 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021 48 3 42 52 Guangdong Agricultural Sciences DOI 10 16768 j issn 1004 874X 2021 03 006 劉開(kāi) 余炳偉 李丹丹 陳娜 曹必好 冷茄子 SmWRKY65 基因克隆及其對(duì)青枯病的抗性分析 J 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021 48 3 42 52 茄子 SmWRKY65 基因克隆及其對(duì)青枯病的抗性分析 劉 開(kāi) 1 余 炳 偉 1 李 丹 丹 2 陳 娜 1 曹 必 好 1 1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 廣東 廣州 510642 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 廣東 廣州 510642 摘 要 目的 通過(guò)克隆 SmWRKY65 Solanum melongena L WRKY65 基因并分析其生物信息學(xué)與功能 以期探究 SmWRKY65 對(duì)茄子青枯病的響應(yīng)情況 方法 以茄子抗病植株 E 31 為試驗(yàn)材料 葉片 cDNA 為模板 通過(guò) PCR 技術(shù)獲得 SmWRKY65 基因 并利用 ExPASy ProtParam tool 對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光 定量 PCR quantitative real time PCR qRT PCR 的方法對(duì)其不同組織部位與抗病 感病材料 E 32 中的響 應(yīng)情況進(jìn)行分析 通過(guò)雙酶切法構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體 運(yùn)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默 virus induced gene silencing VIGS 技術(shù)構(gòu)建 pTRV2 SmWRKY65 載體并侵染茄子抗病植株 結(jié)果 在茄子中成功克隆了 SmWRKY65 基 因 該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?834 個(gè)核苷酸序列 編碼 277 個(gè)氨基酸殘基 在 71 131 區(qū)域具有 1 個(gè)含 60 個(gè)氨基酸 的 WRKY 保守域 定位于細(xì)胞核中 時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn) SmWRKY65 在茄子根組織中的表達(dá)量最高 葉中次 之 莖中最低 qRT PCR 分析表明 SmWRKY65 在茄子抗病和感病材料中均響應(yīng)青枯病菌的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá) VIGS 結(jié)果表明 與清水和 pTRV2 空載對(duì)照相比 接種青枯病菌后 pTRV2 SmWRKY65 沉默植株的葉片表現(xiàn)出 明顯的萎蔫癥狀 結(jié)合 qRT PCR 分析發(fā)現(xiàn) pTRV2 SmWRKY65 表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降 結(jié)論 SmWRKY65 在茄子抗病材料中的表達(dá)水平明顯高于感病材料 且 pTRV2 SmWRKY65 植株與對(duì)照相比表現(xiàn)為易感癥狀 說(shuō)明 SmWRKY65 沉默后茄子抗青枯病的能力下降 表明 SmWRKY65 可能涉及茄子青枯病抗性相關(guān)過(guò)程的調(diào)控 關(guān)鍵詞 茄子 青枯病 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR VIGS 中圖分類(lèi)號(hào) S641 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1004 874X 2021 03 0042 11 Cloning of SmWRKY65 Gene and Its Resistance to Bacterial Wilt in Eggplant LIU Kai 1 YU Bingwei 1 LI Dandan 2 CHEN Na 1 CAO Bihao 1 1 College of Horticulture South China Agricultural University Guangzhou 510642 China 2 College of Agriculture South China Agricultural University Guangzhou 510642 China Abstract Objective The response of SmWRKY65 Solanum melongena L WRKY65 to bacterial wilt of eggplant was explored by cloning SmWRKY65 gene and analyzing its bio information and function Method The eggplant disease resistant plants E 31 and cDNA from its leaves were used as tested materials and template respectively The SmWRKY65 was obtained by PCR technology and bioinformatics analysis was constructed by ExPASy ProtParam tool The expression analysis of different tissue sites and disease resistant and susceptible materials E 32 was performed by quantitative real time PCR qRT PCR method Subcellular localization vector was constructed by double digestion method The pTRV2 SmWRKY65 vector was constructed by virus induced gene silencing VIGS technology and the 43 研究意義 茄子 Solanum melongena L 是茄科茄屬常見(jiàn)的蔬菜作物 起源于東南亞的熱 帶地區(qū) 在我國(guó)南北各地廣泛栽培 其根 莖 葉皆可入藥 果實(shí)中富含蛋白質(zhì) 脂肪 維生素 龍葵堿和多種微量元素 既可用作蔬食 又具有 降血壓 防治胃癌等功效 1 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià) 值極高 青枯病是茄子栽培中常見(jiàn)的細(xì)菌性土傳 病害之一 其致病因子是青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum 主要從根部侵入寄主植物的維 管束部位并迅速擴(kuò)散到地上部組織 對(duì)植株可造 成毀滅性的破壞 2 土溫 20 左右時(shí)為茄子青 枯病的發(fā)病高峰期 微酸性土壤 連作以及氣溫 急劇上升等都會(huì)導(dǎo)致青枯病嚴(yán)重發(fā)生 3 我國(guó)茄 子青枯病發(fā)生較為普遍 發(fā)病時(shí)嚴(yán)重影響茄子的 產(chǎn)量和品質(zhì) 導(dǎo)致茄子大面積減產(chǎn)減收 3 但茄 子抗青枯病的分子機(jī)理十分復(fù)雜 涉及多種因子 調(diào)控 迄今仍未研究清楚 因此 深入開(kāi)展茄子 抗青枯病的相關(guān)研究顯得尤為重要 前人研究進(jìn)展 植物 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是一 種具有多功能調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子 最早是從甘 薯 Dioscorea esculenta Lour Burkill 的 SPF1 基因中被鑒定出來(lái)的 因參與調(diào)控甘薯中的糖信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程而備受關(guān)注 4 之后 陸續(xù)從野燕麥 Avena fatua L 歐 芹 Petroselinum crispum Mill Hill 和 水 稻 Oryza sativa L 的基因 中成功鑒定出相應(yīng)的 WRKY 基因 并詳細(xì)闡明了 其在植物生長(zhǎng)發(fā)育 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其抗逆過(guò)程中發(fā) 揮的重要作用 5 7 近年來(lái) 關(guān)于 WRKY 轉(zhuǎn)錄 因子響應(yīng)生物脅迫及非生物脅迫相關(guān)過(guò)程的研究 多有報(bào)道 8 研究發(fā)現(xiàn) 小麥 TaWRKY2 和陸地 棉 GhWRKY33 基因是響應(yīng)干旱調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因 過(guò)表達(dá) TaWRKY2 和 GhWRKY33 基因能夠分別增 強(qiáng)小麥和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗旱性 9 10 決登 偉等 11 發(fā)現(xiàn) 玉米 ZmWRKY25 like 基因在響應(yīng) 鹽脅迫和低溫脅迫中上調(diào)表達(dá) Sun 等 12 認(rèn)為 山葡萄 VaWRKY33 基因在低溫脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)以 增強(qiáng)植株的耐寒性 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) WRKY 轉(zhuǎn) 錄因子在調(diào)控植物抗病性方面起關(guān)鍵作用 周茜 茜等 13 研究發(fā)現(xiàn) 蘋(píng)果 MdWRKY40 基因通過(guò)介 導(dǎo)水楊酸 Salicylic acid SA 信號(hào)途徑正向調(diào) 控蘋(píng)果對(duì)輪紋病菌的抗性 龍琴等 14 認(rèn)為 過(guò) 表達(dá) CsWRKY61 能夠激活與生物脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 相關(guān)的途徑 增強(qiáng)柑橘對(duì)潰瘍病的抗性 殷麗華 等 15 研究發(fā)現(xiàn) 小豆 VaWRKY33 基因能夠響應(yīng) 豇豆單胞銹菌的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá) 并明顯提高小豆 銹病的抗性 在擬南芥抗病性研究中發(fā)現(xiàn) 擬南 芥 AtWRKY61 和 AtWRKY70 基因分別正向調(diào)控蕪 菁皺葉病毒和丁香假單胞菌的抗性 16 17 王丹 等 18 研究發(fā)現(xiàn) VqWRKY53 通過(guò)促進(jìn) SA 和芪 類(lèi)物質(zhì)的合成 可增強(qiáng)中國(guó)野生毛葡萄植株的抗 病性 本研究切入點(diǎn) 目前已有研究在茄屬植物 歐白英 Solanum dulcamara 的基因組中克隆得 到 WRKY 基因 并對(duì)其相應(yīng)的生物信息學(xué)功能進(jìn) 行了分析 19 但與茄子青枯病抗性相關(guān)的研究 仍鮮見(jiàn)報(bào)道 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題 本研究通過(guò) 克隆與茄子青枯病抗性相關(guān)的 SmWRKY65 基因 對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué) 亞細(xì)胞定位及時(shí)空表達(dá)模 disease resistant eggplant plants were infected Result The SmWRKY65 gene was successfully cloned in eggplant The gene contains 834 bp nucleotide sequences codes 277 amino acid residues in its open reading frame and concludes a WRKY conserved domain containing 60 amino acid in the regions of 71 131 The analysis of subcellular localization showed that SmWRKY65 GFP fusion protein was found in the cell nucleus The expression analysis of different tissues revealed that SmWRKY65 had highest expression in eggplant roots followed by leaves and stems The qRT PCR analysis testified that SmWRKY65 was up regulated in response to the induction of bacterial wilt in eggplant resistant and susceptible plants The VIGS results showed that the leaves of pTRV2 SmWRKY65 silent plants was observed clear wilting symptoms when compared with water and pTRV2 control vector By qRT PCR profiling it was observed that pTRV2 SmWRKY65 expression was obviously decreased when compared with control groups Conclusion The expression level in disease resistant eggplant materials was significantly higher than that in susceptible materials and the pTRV2 SmWRKY65 plants showed more symptoms of susceptibility when compared with control groups indicating that the silence of SmWRKY65 reduced the resistance to bacterial wilt of eggplants and SmWRKY65 was possibly related to the process regulation of eggplant resistance to bacterial wilt Key words eggplant bacterial wilt WRKY transcription factor real time fluorescence quantitative PCR virus induced gene silencing VIGS 44 式分析 并以清水和 pTRV2 空載為對(duì)照 構(gòu)建 pTRV2 SmWRKY65 載體 探究SmWRKY65 在茄 子抗病植株 E 31 中沉默后對(duì)茄子青枯病的響 應(yīng)情況 以期為茄子青枯病抗病機(jī)理的相關(guān)研究 提供理論基礎(chǔ) 為茄子青枯病抗性品種的選育提 供參考 1 材料與方法 1 1 試驗(yàn)材料 茄子抗病材料 S melongena L E 31 R 和感病材料 S melongena L E 32 S 由 曹 必 好教授提供 青枯菌致病菌株從感病材料中分離 得到 VIGS 載體構(gòu)建所需的煙草脆裂病毒載體 pTRV 1 和 pTRV 2 由華南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與 種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存 DH5 大腸桿菌轉(zhuǎn)化 菌株和 GV3101 轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌菌株均購(gòu)自生工生物科 技有限公司 RNA 提取試劑盒 Trizol 購(gòu)自北京華越洋生物 科技有限公司 PCR 反應(yīng)試劑盒 2 HiFiTaq PCR StarMix 快速 DNA 膠回收試劑盒 StarPrep 和快速 質(zhì)粒小提試劑盒 StarPrep 均為 GenStar 產(chǎn)品 反 轉(zhuǎn)錄試劑盒 HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR 和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒 a SYBR Premix Ex Taq kit 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 茄子不同組織部位總R N A的提取與 cDNA 的合成 在茄子幼苗三葉期時(shí)分別采集茄 子根 莖 葉部位的樣品 用錫箔紙包裹并迅 速放入液氮中 每個(gè)樣品 3 次重復(fù)并做好標(biāo)記 之后采用 Trizol 試劑盒的方法分別提取茄子根 莖 葉的 RNA 并采用 HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR 試 劑 盒 進(jìn) 行 逆 轉(zhuǎn) 錄 反 應(yīng) 合 成 cDNA 詳細(xì)步驟參照說(shuō)明書(shū) cDNA 合成 PCR 反 應(yīng)體系 10 L 反應(yīng)程序?yàn)?25 10 min 50 30 min 85 5 min 1 2 2 SmWRKY65 序列的獲得與基因克隆 本 課題組前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到 WRKY65 基因 序 列 登 錄 號(hào) Sme2 5 00423 1 g00013 1 利 用 Primer 5 0 軟 件 設(shè) 計(jì) 引 物 SmWRKY65 F SmWRKY65 R 表 1 以茄子葉片 cDNA 為模 板通過(guò) PCR 10 L 體系 擴(kuò)增得到 SmWRKY65 基因序列 PCR 反應(yīng)程序 94 預(yù)變性 2 min 94 變性 30 s 55 退火 30 s 72 延伸 50 s 32 個(gè)循環(huán) 72 延伸 5 min 采用 1 瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物的特異性 將條帶明亮 大 小與預(yù)期一致的條帶采用 StarPrep 快速 DNA 膠回 收試劑盒進(jìn)行純化 1 2 3 SmWRKY65 的生物信息分析 利用 ExPASy ProtParam tool http www expasy org tools protparam html 對(duì) SmWRKY65 蛋白理化性質(zhì)進(jìn) 行 分 析 使 用 ProtScale http ca expasy org tools protscale html 和 SOPM 工 具 https npsa prabi ibcp fr cgibin npsa automat pl page np sa sopma html 分 別 預(yù) 測(cè) SmWRKY65 蛋 白 親 疏 水 性 和 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 類(lèi) 型 使 用 NCBI CD Search https www ncbi nlm nih gov Struc ture cdd wrpsb cgi 和 PredictProtein 工具 http www predictprotein org 對(duì) SmWRKY65 蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域 和結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò) NCBI Blast 在線比對(duì)工具 檢索 SmWRKY65 同源性基因 將相似性較高的同 源性序列下載后 利用 MEGA 7 0 軟件 UPGMA 法 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù) 1 2 4 PCR 產(chǎn)物的連接與 SmWRKY65 質(zhì)粒的提 取 將 上 述 1 2 2 中 的 PCR 產(chǎn) 物 連 接 pMD 19 T 載體 pMD 19 T 載體 Solution I 回收產(chǎn)物 0 5 L 4 5 L 5 L 之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) DH5 用 pMD19 T 通用引物檢測(cè)陽(yáng)性菌落 委 托廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序 確定重 組子 挑取重組子進(jìn)行擴(kuò)搖 采用 StarPrep 快速 質(zhì)粒小提試劑盒提取 SmWRKY65 質(zhì)粒 具體步 驟參照說(shuō)明書(shū) 1 2 5 SmWRKY65 的時(shí)空表達(dá)模式分析 利用 Primer 5 0 軟 件 設(shè) 計(jì) SmWRKY65 熒光定量引物 q SmWRKY65 F q SmWRKY65 R 表 1 以茄子內(nèi)參 18S rRNA 18S rRNA F 18S rRNA R 表 1 為對(duì)照 采用 a SYBR Premix Ex Taq Kit 試 劑盒對(duì)茄子根 莖 葉組織進(jìn)行 SmWRKY65 實(shí) 時(shí)熒光定量 qRT PCR 表達(dá)量的測(cè)定 詳細(xì) 步驟參照說(shuō)明書(shū) 再分別以茄子抗病和感病植 株為材料 在茄子苗 3 葉期接種青枯病菌以分析 SmWRKY65 在茄子抗病和感病植株中的表達(dá)情 況 并在接種后 0 3 6 9 h 4 個(gè)時(shí)間段分別采 集抗病 感病植株葉片 以茄子內(nèi)參 18S rRNA 18S rRNA F 18S rRNA R 表 1 為對(duì)照 采 用 SmWRKY65 熒光定量引物 q SmWRKY65 F q SmWRKY65 R 表 1 進(jìn) 行 qRT PCR 表 達(dá) 量 的測(cè)定 以分析 SmWRKY65 在抗病和感病材料中 的表達(dá)量差異 qRT PCR 程序?yàn)?95 預(yù)變性 2 min 95 變性 10 s 56 退火 20 s 72 延 45 伸 35 s 35 個(gè)循環(huán) 每個(gè)樣品 3 次生物學(xué)重復(fù) 最后取平均值進(jìn)行分析 基因的相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用 2 Ct 方法進(jìn)行分析 20 1 2 6 構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體及轉(zhuǎn)化洋蔥 利用 Primer 5 0 軟件設(shè)計(jì) SmWRKY65 亞細(xì)胞定位引物 SmWRKY65 GFP EB F SmWRKY65 GFP EB R 表 1 通過(guò) PCR 反應(yīng)克隆 SmWRKY65 亞細(xì)胞定位目的片段 使用 EcoR I 和 BamH I 酶 對(duì)亞細(xì)胞定位載體 pC018 和目的片段進(jìn)行雙酶切 并連接成重組質(zhì)粒 SmWRKY65 GFP 測(cè)序后將重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101 轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮組織 3 d 后在顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位結(jié)果 1 2 7 VIGS 載體的構(gòu)建 通過(guò)在線工具 vigs 尋找特異性的 VIGS 載體區(qū)域 根據(jù) pTRV2 載體多克隆位點(diǎn)所包含的酶切位點(diǎn) 設(shè) 計(jì) 1 對(duì) 特 異 性 引 物 pTRV2 WRKY65 F pTRV2 WRKY65 R 表 1 以茄子葉片 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)獲得長(zhǎng)度為 250 bp 左右的 特異性 PCR 產(chǎn)物 用雙酶切 EcoR I 和 BamH I 法將產(chǎn)物片段連接到 pTRV2 載體上 之后轉(zhuǎn)入大 腸桿菌 DH5 陽(yáng)性單菌落進(jìn)行 PCR 菌落篩選 送廣州擎科生物科技有限公司測(cè)序 確定重組子 將陽(yáng)性單菌落進(jìn)行擴(kuò)搖 提取重組質(zhì)粒 pTRV2 SmWRKY65 后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101 用于侵染 1 2 8 農(nóng)桿菌侵染茄子幼苗 將抗病和感病茄子 種子分別播種在含泥炭和珍珠巖的混合基質(zhì)中 于 25 16 h 光照和 8 h 黑暗的培養(yǎng)室中進(jìn)行培 養(yǎng) 當(dāng)茄子幼苗長(zhǎng)至 3 4 片真葉時(shí) 吸取含有重 組質(zhì)粒 pTRV2 SmWRKY65 的陽(yáng)性菌落擴(kuò)搖后 配制成侵染液 并將分離到的青枯菌采用傷根斷 根法對(duì)茄子幼苗進(jìn)行侵染 青枯菌的分離與接種 參照曹必好等 21 的方法 每組 15 株 3 次重復(fù) 之后在 16 60 的相對(duì)濕度下暗處理 1 d 隨后置于培養(yǎng)室中生長(zhǎng) 3 d 后采用斷根法接種 青枯病菌 觀察其表型變化并拍照 2 周后調(diào)查 統(tǒng)計(jì)病情指數(shù) 方法參照 Chen 等 22 之后通過(guò) qRT PCR 法測(cè)定 pTRV2 SmWRKY65 沉默植株表 達(dá)量 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS Statistics 17 0 進(jìn)行 t 檢驗(yàn) 采用 Excel 2010 制圖 2 結(jié)果與分析 2 1 SmWRKY65 基因的克隆 以茄子葉片 cDNA 為模板 通過(guò) PCR 擴(kuò)增 得 到 948 bp 的 SmWRKY65 片段 經(jīng) 1 瓊脂糖 凝膠電泳 結(jié)果顯示目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致 圖 1 將目的條帶切膠回收 純化 測(cè)序 對(duì) SmWRKY65 測(cè)序序列與 WRKY65 原始序列 登 錄號(hào) Sme2 5 00423 1 g00013 1 在 DNAMAN 8 0 工具上進(jìn)行比對(duì) 結(jié)果顯示同源性為 88 06 表 明在茄子中成功克隆了 SmWRKY65 圖 2 M 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 948bp 1 M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 電泳條帶 M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 electrophoresis band 圖 1 SmWRKY65 電泳結(jié)果 Fig 1 Electropherogram result of SmWRKY65 2 2 SmWRKY65 蛋白的生物信息學(xué)分析 S m W R K Y 6 5蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯 示 該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?834 個(gè)核苷酸序列 編碼2 7 7個(gè)氨基酸殘基 蛋白相對(duì)分子量大 表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 引物名稱(chēng) Primer name 序列 5 3 Sequence 5 3 SmWRKY65 F ATGGAAGATAGGCTATACAAAAGTC SmWRKY65 R TTATCCTGTACCGCCGCAAC q SmWRKY65 F GGATATTATCGATGCAGTAG q SmWRKY65 R GGTAGATGTGGTAGGTGAAC 18S rRNA F CGCGCGCTACACTGATGTATTCAA 18S rRNA R TACAAAGGGCAGGGACGTAGTCAA SmWRKY65 GFP EB F gataagcttgatatcgaattcATGGAAGATAG TTCATACAAAAATCTATTTT SmWRKY65 GFP EB R tttacccatactagtggatccTCCTGTACCTCC GCAGCAGG pTRV2 WRKY65 F TAAGGTTACCGAATTCGGATATTA TCGATGCAGTAG pTRV2 WRKY65 R GCTCGGTACCGGATCCGGTAGAT GTGGTAGGTGAAC 46 小 為 30 155 21 ku 等 電 點(diǎn) 為 5 51 分 子 式 為 C 1304 H 1998 N 30 O 430 S 13 原子總量為 4 115 預(yù)測(cè)該蛋 白屬于親水性蛋白 對(duì) SmWRKY65 蛋白的二級(jí) 結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè) 結(jié)果顯示 其主要由不規(guī)則盤(pán)繞 結(jié)構(gòu) 72 92 螺旋 12 27 延伸鏈 11 91 和 轉(zhuǎn)角 2 89 等結(jié)構(gòu)元件組 成 圖 3 預(yù)測(cè)該蛋白屬于 W R K Y 家族 在 71 131 區(qū)域具有 1 個(gè)含 60 個(gè)氨基酸的 WRKY 保 守域 可以特異結(jié)合 DNA 序列 T T TGAC C T 具有 DNA 結(jié)合位點(diǎn) 3 個(gè) 蛋白結(jié)合位 點(diǎn) 3 個(gè) 核苷酸多肽鏈結(jié)合位點(diǎn) 2 個(gè) 大分子結(jié) 合區(qū)域 7 個(gè) 主要多集中在 WRKY 家族的保守結(jié) 構(gòu)域內(nèi) 預(yù)測(cè)該基因定位于細(xì)胞核中 圖 4 通過(guò) NCBI 上 Blast 在線比對(duì)工具 將檢索到的 12 條與 SmWRKY65 同源性較高的基因進(jìn)行多序列比 對(duì) 使用 MEGA 7 0 21 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù) 結(jié)果表 明 茄子 SmWRKY65 與馬鈴薯 番茄的 WRKY65 同源性最高 圖 5 WRKY65 SmWRKY65 Consensus 80 73 160 153 240 230 320 310 400 390 480 470 560 550 640 630 720 710 800 790 880 870 888 950 888 952 WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus 圖 2 SmWRKY65 序列比對(duì)結(jié)果 Fig 2 Comparison result of SmWRKY65 sequences 47 XP 010323672 1 WRKY65 isoform X1 Solanum lycopersicunm XP 015081016 1 WRKY65 isoform X1 Solanum pennellii XP 015081017 1 WRKY69 isoform X2 Solanum pennellii XP 006348892 1 WRKY65 isoform X1 Solanum tuberosum XP 006348893 1 WRKY69 isoform X2 Solanum tuberosum Sme2 5 00423 1 g00013 1 SmWRKY Solanum melongena XP 004243269 1 WRKY69 isoform X2 Solanum lycopersicunm XP 016580885 1 WRKY65 isoform X1 Capsicum annuum KAF3641841 1 WRKY69 like isoform X2 Capsicum annuum XP 016580886 1 WRKY65 isoform X2 Capsicum annuum PHT76738 1 hypothetical protein T459 20260 Capsicum annuum PHU12509 1 WRKY14 Capsicum chinense PHT43547 1 WRKY14 Capsicum baccatum 56 64 98 56 58 0 05 圖 5 SmWRKY65 同源進(jìn)化樹(shù)分析 Fig 5 Analysis of homologous tree of SmWRKY65 2 3 SmWRKY65 的時(shí)空表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位 分析 以茄子葉片 cDNA 為模板 通過(guò) PCR 檢測(cè) SmWRKY65 熒光定量引物的特異性 經(jīng) 1 瓊脂 糖凝膠電泳 結(jié)果顯示在 250 bp 左右有 1 條明亮 且符合預(yù)期的條帶 圖 6A 說(shuō)明引物特異性較 好 可用于后續(xù)試驗(yàn) 對(duì)茄子根 莖 葉不同組 織部位表達(dá)量的分析結(jié)果顯示 SmWRKY65 在茄 子根組織部位中的表達(dá)量最高 在葉中的表達(dá)量 次之 莖中最低 圖 6B 在茄子苗期接種青枯 病菌后 0 3 6 9 h 4 個(gè)時(shí)間段分別采集抗病 10 20 30 40 50 60 70 h 螺旋 e 延伸鏈 c 不規(guī)則盤(pán)繞結(jié)構(gòu) t 轉(zhuǎn)角 h helix e Extended strand c Random coil structure t turn 圖 3 SmWRKY65 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Fig 3 Secondary structure prediction of SmWRKY65 protein 圖 4 SmWRKY65 蛋白結(jié)合位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) Fig 4 Binding sites and subcellular localization prediction of SmWRKY65 protein Query seq Specific hits Superfamilies Protein Protein Protein Polynucelotide Binding Sites Prediction Protein Disorder and Flexibility Prediction Secondary Structure and Solvent Accessibility Prediction Subcellular Localization Prediction WRKY WRKY superfamily 50 1 100 150 200 250 277 277 48 感病植株葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析 結(jié)果表明 SmWRKY65 在抗病和感病材料中的表達(dá)量均隨接 種時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高 9 h 時(shí)達(dá)到最高 且在抗病 材料中的表達(dá)水平明顯高于在感病材料中的表達(dá) 水平 圖 6C 說(shuō)明 SmWRKY65 響應(yīng)茄子青枯 病抗性相關(guān)基因的表達(dá) 使用 EcoR I 和 BamH I 酶對(duì)亞細(xì)胞定位載體 pC018 和亞細(xì)胞定位引物成功克隆出的 PCR 片段 進(jìn)行雙酶切 并連接成大小為 831 bp 的重組質(zhì)粒 SmWRKY65 GFP 圖 7A 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿 菌后轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞 在共聚焦顯微鏡下觀察 到 SmWRKY65 定位在細(xì)胞核中表達(dá) 圖 7B 2000bp 1000bp 35S GFP 空載 35S GFP vector control 明場(chǎng) Bright GFP 熒光 GFP fluorescence 疊加圖像 Merge 35S SmWRKY65 GFP 750bp 500bp 250bp 100bp A M 1 B 831bp M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 GFP 電泳條帶 M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 GFP electrophoretic bands 圖 7 SmWRKY65 亞細(xì)胞定位分析 Fig 7 Subcellular localization analysis of SmWRKY65 接種時(shí)間 Vaccination time h R bw S bw C SmWRKY65 相對(duì)表達(dá)量 SmWRKY65 relative expression levels 0 0 3 6 9 3 6 9 2 5 2 1 5 1 0 5 0 A SmWRKY65 相對(duì)表達(dá)量 SmWRKY65 relative expression levels M 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 根 Root 莖 Stem 葉 Leaf 組織部位 Tissue 1 0 5 0 1 B M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 熒光定量 PCR 產(chǎn)物 R 抗病型茄子 E 31 S 感病型茄子 E 32 bw 接種青枯病 M DNA Marker DL2000 1 Fluorescence quantitative PCR products of SmWRKY65 R Disease resistant eggplants E 31 S Disease susceptible eggplants bw Bacterial wilt inoculation 圖 6 茄子不同組織及抗感病植株中 SmWRKY65 的表達(dá)分析 Fig 6 SmWRKY65 expression of different tissues and disease resistant and disease susceptible plants of eggplant 49 這與預(yù)測(cè)結(jié)果一致 2 4 SmWRKY6 沉默在抗病茄子中響應(yīng)青枯病的 情況 2 4 1 pTRV2 SmWRKY65 載體構(gòu)建結(jié)果 以茄 子葉片為材料提取 RNA 并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成 cDNA 再以 cDNA 為模板 利用構(gòu)建 VIGS 載體 所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 1 瓊脂糖 凝膠電泳顯示 獲得長(zhǎng)度為 242 bp 的 PCR 產(chǎn)物 圖 8A 將產(chǎn)物片段和 pTRV2 載體同時(shí)用 EcoR I 和 BamH I 進(jìn)行雙酶切后成功將 SmWRKY65 連接 到 pTRV2 載體上獲得重組質(zhì)粒 經(jīng)測(cè)序保證連接 片段和讀碼方向正確后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101 從 陽(yáng)性菌落檢測(cè)結(jié)果來(lái)看 與 pTRV2 圖 8B1 空 載相比 pTRV2 SmWRKY65 圖 8B2 載體構(gòu)建 成功 2 4 2 青枯病菌接種 VIGS 沉默植株 為了驗(yàn)證 pTRV2 WRKY65 沉默植株對(duì)茄子青枯病的響應(yīng)情 況 在 3 4 片真葉時(shí) 對(duì)茄子抗病植株接種青枯 病病原菌 接種 7 d 后觀察到接種清水的葉片均 沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的萎蔫癥狀 接種 pTRV2 空載 的植株僅有 1 片葉片出現(xiàn)萎蔫 而接種 pTRV2 WRKY65 的 15 株植株幾乎全部表現(xiàn)出萎蔫癥狀 接種 2 周后 對(duì) pTRV2 WRKY65 植株進(jìn)行病情指 數(shù)調(diào)查 結(jié)果 表 2 表明 SmWRKY65 基因被 沉默后影響了抗病材料對(duì)青枯病的抵御能力 即 表現(xiàn)為感病癥狀 pTRV2 SmWRKY65 實(shí)時(shí)熒光定 量檢測(cè)結(jié)果 圖 9 顯示 與清水和 pTRV2 空載 相比 pTRV2 SmWRKY65 表達(dá)量明顯下降 表 2 VIGS 沉默植株的病情指數(shù)統(tǒng)計(jì) Table 2 Statistics of disease index of VIGS silent plants 材料 Material 試驗(yàn)重復(fù) Test repetition times 評(píng)估分級(jí) Scale of evaluation 0 1 2 3 4 清水 Water 1 15 0 0 0 0 2 15 0 0 0 0 3 15 0 0 0 0 pTRV2 空載 pTRV2 control vector 1 15 0 0 0 0 2 14 1 0 0 0 3 14 1 0 0 0 pTRV2 WRKY65 1 0 2 8 5 0 2 0 3 8 3 1 3 0 4 7 4 0 注 評(píng)估分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為 0 表示沒(méi)有葉片枯萎 1 表示 1 2 片葉子枯萎 2 表示 3 片以上葉子枯萎 3 表示所有葉子枯萎 4 表示死亡 0 2 級(jí)被 認(rèn)為抗青枯病 3 4 級(jí)被認(rèn)為感病 Note The standard of scale of evaluation 0 healthy 1 one or two leaves wilted 2 three or more leaves wilte