中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021 54 10 2118 2131 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2021 10 008 收稿日期 2020 07 31 接受日期 2020 09 07 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 2017YFD0201900 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金 CARS 15 18 國(guó)家自然科學(xué)基金 31301668 轉(zhuǎn) 基因棉花環(huán)境安全性評(píng)價(jià)技術(shù) 2016ZX08011 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院基金 611613 聯(lián)系方式 譚永安 E mail kellytan001 通信作者肖留斌 E mail xlb 通信作者郝德君 E mail dejunhao 開放科學(xué) 資源服務(wù) 標(biāo)識(shí)碼 OSID 綠盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆 抗體制備及在蛻皮 激素誘導(dǎo)下的應(yīng)答 譚永安 1 趙旭東 2 姜義平 1 趙靜 1 肖留斌 1 郝德君 2 1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 南京210014 2 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林學(xué)院 南京210037 摘要 目的 克隆綠盲蝽 Apolygus lucorum 雷帕霉素靶標(biāo)全長(zhǎng)基因 AlTOR 研究 AlTOR 時(shí)空表達(dá)特性及在外源蛻皮 激素 20E 誘導(dǎo)下的應(yīng)答響應(yīng) 進(jìn)一步獲得原核表達(dá)的重組蛋白及制備多克隆抗體 分析該抗體的特異性 為后續(xù)研究 AlTOR 蛋白功能打下基礎(chǔ) 方法 RACE 法克隆 AlTOR 基因序列全長(zhǎng) qRT PCR 分析 AlTOR 表達(dá)特性以及在 20E 及其抑制劑 U73122 誘導(dǎo)下的應(yīng)答響應(yīng) 將含有 AlTOR 序列T載體經(jīng) EcoR I及 Xho I 雙酶切 構(gòu)建原核表達(dá)載體 pCzn1 AlTOR 經(jīng) 20 0 5 mmol L 1 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá) 變性 復(fù)性和蛋白純化后 以獲得 AlTOR 重組蛋白 最后再通過(guò)免疫 制備 AlTOR 蛋白多克隆抗體 Wester n blot 評(píng)價(jià)該抗體的特異性 結(jié)果 AlTOR 的開放閱讀框編碼包含 435 個(gè)氨基酸 具有典型的 TOR 基因序列特征 即 SIN1 結(jié)構(gòu)域 高度保守的 CRIM 結(jié)構(gòu)域及 PH 域 AlTOR 在綠盲蝽不同日齡 不同組織中均有表達(dá) 且在 1 日齡以及脂肪體中表達(dá) 量最高 20E 可誘導(dǎo)綠盲蝽不同日齡若蟲期 AlTOR 的表達(dá) 同時(shí)也能誘導(dǎo)成蟲頭 翅 卵巢和脂肪體中 AlTOR 表達(dá)上調(diào) 分 別上調(diào) 200 00 118 89 20 53 和 60 82 而 U73122 在中腸和卵巢中會(huì)顯著抑制 AlTOR 的表達(dá) 經(jīng)雙酶切的重組克隆載 體可成功亞克隆到 pCzn1 載體上 命名為 pCzn1 AlTOR IPTG 誘導(dǎo)的重組質(zhì)?？商禺愋员磉_(dá)一個(gè)約 36 kD 的蛋白 且主 要以 包涵體形式存在 經(jīng) Ni IDA 親和層析純化后 僅在 36 kD 附近有一條明顯的特異性條帶 進(jìn)一步免疫及間接 ELISA 方法確 定抗血清對(duì) TOR 蛋白的效價(jià) Western blot 分析表明制備的多克隆抗體可以特異性與 AlTOR 重組蛋白及綠盲蝽 3 齡若蟲總 蛋白結(jié)合 說(shuō)明制備的 AlTOR 多克隆抗體特異性較好 可以用于后續(xù)的蛋白研究 結(jié)論 AlTOR 在綠盲蝽體內(nèi)的表達(dá)譜顯 示出發(fā)育階段特異性和組織特異性 20E 及其抑制劑誘導(dǎo)后 AlTOR 呈現(xiàn)出相反的應(yīng)答反應(yīng) 本研究獲得的 AlTOR 重組蛋白 的多克隆抗體具有高特異性 關(guān)鍵詞 綠盲蝽 雷帕霉素靶標(biāo) 基因克隆 蛻皮激素 多克隆抗體 表達(dá) Cloning Preparation of Antibody and Response Induced by 20 Hydroxyecdysone of Target of Rapamycin in Apolygus lucorum TAN YongAn 1 ZHAO XuDong 2 JIANG YiPing 1 ZHAO Jing 1 XIAO LiuBin 1 HAO DeJun 2 1 Institute of Plant Protection Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Nanjing 210014 2 Co Innovation Center for the Sustainable Forestry in Southern China College of Forestry Nanjing Forestry University Nanjing 210037 Abstract Objective The objective of this study is to clone the target of rapamycin gene TOR of Apolygus lucorum AlTOR analyze the expression profile of AlTOR as well as its expression patterns after injection of 20 hydroxyecdysone 20E and its inhibitor U73122 obtain the recombinant protein and antibody against AlTOR protein and to lay the foundation for the further study 10期 譚永安等 綠盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆 抗體制備及在蛻皮激素誘導(dǎo)下的應(yīng)答 2119 of AlTOR protein function Method The full length of AlTOR was cloned by RACE method Using qRT PCR technique the expression pattern of AlTOR was determined at different developmental stages and different tissues in A lucorum as well as its expression patterns after injection of 20E and U73122 To construct its prokaryotic expression pCzn1 AlTOR T vector containing the target gene was digested with the restriction enzyme EcoR I and Xho I and subcloned The recombinant plasmid containing target gene was specifically expressed after induction by IPTG The target recombinant protein has over expressed and has been purified by using Ni NTA agarose The polyclonal antibody was obtained by rabbit immunity cell fusion and ascites preparation and Western blot was used to detect the specificity of antibody Result The open reading frame of AlTOR encodes 435 amino acids AlTOR protein has the typical domains including the SIN1 domain highly conserved CRIM domain and PH domain qRT PCR results showed that AlTOR was expressed in 1 day old to 16 day old of A lucorum in which the expression level was the highest at 1 day old AlTOR was expressed in all tissues of A lucorum female adults and the fat body had the highest expression level 20E could induce the expression of AlTOR at different day old nymphs and could also induce the up regulated expression of AlTOR in the head wing ovary and fat body of the female adults which was increased by 200 00 118 89 20 53 and 60 82 respectively while U73122 significantly suppressed AlTOR expression in the midgut and ovary The vector containing AlTOR was digested and linked to the vector pCzn1 The recombinant plasmid pCzn1 AlTOR expressed the target recombinant protein of 36 kD after induction by IPTG The 36 kD target protein from the strain containing AlTOR was obtained by the Ni NTA agarose and used as the antigen and one cell line polyclonal antibody could specifically bind to the AlTOR recombinant protein and the total protein of the 3rd instar nymph of A lucorum indicating that the prepared AlTOR polyclonal antibody has good specificity Conclusion The expression of AlTOR shows the developmental stage and tissue specificity After the induction of 20E and its inhibitor AlTOR shows the opposite responses The obtained polyclonal antibody against AlTOR recombinant protein is highly specific Key words Apolygus lucorum target of rapamycin TOR gene cloning 20 hydroxyecdysone 20E polyclonal antibody expression 0 引言 研究意義 綠盲蝽 Apolygus lucorum 屬半翅 目 Hemiptera 盲蝽科 Miridae 寄主范圍廣泛 可危害棉花等多種經(jīng)濟(jì)作物 1 2 20世紀(jì)90年代末以 來(lái) 由于Bt棉的大面積推廣種植和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào) 整 綠盲蝽種群數(shù)量急劇上升 已成為棉田主要害蟲 并迅速波及棗樹 葡萄 櫻桃 桃等多種果樹 嚴(yán)重 影響其產(chǎn)量及品質(zhì) 生產(chǎn)上對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期依賴勢(shì) 必會(huì)導(dǎo)致綠盲蝽的抗藥性日漸增強(qiáng) 從而造成防治效 果下降 3 4 因此 目前綠盲蝽防控面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn) 亟 需開拓基于新靶標(biāo)的有效防控技術(shù) 前人研究進(jìn)展 雷帕霉素靶蛋白 target of rapamycin TOR 是一種 絲氨酸 蘇氨酸激酶 在細(xì)胞代謝 生長(zhǎng)及增殖方面至 關(guān)重要 5 6 TOR可分為TOR復(fù)合物1 TOR complex 1 TORC1 和TOR復(fù)合物2 TOR complex 2 TORC2 TORC1是TOR與RapTOR regulatory associated protein of mTOR 及mLST8 mammalian lethal with Sec13 protein 8 形成的一個(gè)對(duì)雷帕霉素敏 感的復(fù)合物 可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯 細(xì)胞凋亡及 細(xì)胞周期等關(guān)鍵生理過(guò)程 7 8 TORC2是由RicTOR rapamycin insensitive cornpanion of mTOR Sinl 也稱為Mip1 與mLST8 mTOR共同形成的對(duì) 雷帕霉素不敏感的復(fù)合物 通過(guò)調(diào)控蛋白激酶B protein kinase B PKB 和蛋白激酶C protein kinase C PKC 的活化 主要參與細(xì)胞極性 空間及骨 架結(jié)構(gòu)的形成 9 在昆蟲中 TOR可通過(guò)直接耦合 前胸腺中的營(yíng)養(yǎng)感應(yīng) 從而在蛻皮激素 20E 生 成及蛻皮過(guò)程中發(fā)揮重要作用 10 11 研究表明 抑 制TOR的表達(dá)可造成幼蟲發(fā)育歷期延長(zhǎng) 同時(shí)與 蛻皮激素合成相關(guān)基因的表達(dá)量下調(diào) 表明昆蟲在 生長(zhǎng)發(fā)育以及蛻皮變態(tài)時(shí)需要TOR的參與 此外 在 幼蟲營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下 TOR信號(hào)的激活會(huì)誘導(dǎo)蛻 皮激素的生成 使幼蟲完成正常蛻皮及變態(tài)行為 12 TOR信號(hào)也可受蛻皮激素的調(diào)控 13 14 對(duì)黑腹果蠅 Drosophila melanogaster 的研究發(fā)現(xiàn) 當(dāng)幼蟲攝 入營(yíng)養(yǎng)時(shí) 蛻皮激素抑制TOR信號(hào)介導(dǎo)調(diào)控胰島素 樣肽 ILP 生成胰島素分泌細(xì)胞來(lái)調(diào)控果蠅的生長(zhǎng) 發(fā)育 15 16 本研究切入點(diǎn) 目前對(duì)于TOR的研究多 集中在植物 哺乳動(dòng)物及一些模式昆蟲上 17 19 對(duì)綠 盲蝽AlTOR的相關(guān)研究尚未見報(bào)道 擬解決的關(guān)鍵 問題 采用RACE技術(shù)從綠盲蝽中擴(kuò)增AlTOR全長(zhǎng) 運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和同源進(jìn) 化分析 并利用qRT PCR闡明其時(shí)空表達(dá)動(dòng)態(tài)及20E 對(duì)其表達(dá)的影響 同時(shí)將其在原核細(xì)胞中進(jìn)行高效表 達(dá) 篩選最佳表達(dá)條件 以獲得純化蛋白 最后制備 2120 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 54卷 特異性的抗體 為在蛋白水平進(jìn)一步研究該基因的功 能打下基礎(chǔ) 1 材料與方法 試驗(yàn)于2018年9月至2019年12月在江蘇省農(nóng)業(yè) 科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成 1 1 供試?yán)ハx 綠盲蝽于2018年采自江蘇沿海棉區(qū)的大豐市蠶 豆田 33 11 N 120 25 E 室內(nèi)用新鮮四季豆 Phaseolus vulgaris 續(xù)代飼養(yǎng) 飼養(yǎng)條件為溫度 27 0 5 相對(duì)濕度 70 5 光周期14L 10D 1 2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒 Promega M MLV反轉(zhuǎn)錄 試劑盒 Promega BD SMART TM RACE cDNA Amplification Kit 寶生物工程 大連 有限公司 pCzn1表達(dá)載體 PFU DNA聚合酶 南京鐘鼎生物技 術(shù)有限公司 TOP10菌株 天根生化科技有限公司 大腸桿菌 Escherichia coli Arctic Express DE3 Agilent 卡那霉素 咪唑 尿素 上海生工生物 工程有限公司 限制性內(nèi)切酶 TaKaRa Protein Marker Thermo IPTG Acr Bis Tris Sigma SDS Amresco TEMED BIO RAD 高糖 Tyrptone Yeast Extract OXOID Agarose 上海賽百盛基因 技術(shù)有限公司 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純 Ni 2 IDA 親和層析膠 Novagen HexIOS分光光度計(jì) Allegra 21R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Beckman 臺(tái)式高速離 心機(jī) Sorval Biologic LP層析系統(tǒng) Mini Protean II 垂直平板電泳系統(tǒng) 水平電泳系統(tǒng) BIO RAD PTC 200基因擴(kuò)增儀 MJ Research 20E U73211 Sigma 1 3 AlTOR 全長(zhǎng)基因的克隆 基于實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及已報(bào)道昆 蟲TOR進(jìn)行BLAST搜索 篩選綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組中可能 的TOR基因片段序列 從而進(jìn)行克隆驗(yàn)證 根據(jù)獲得 的序列設(shè)計(jì)特異性引物 表1 進(jìn)行AlTOR 5 和3 端序列的克隆 取綠盲蝽3齡若蟲20頭 Trizol法提 取總RNA后合成cDNA第1鏈 根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性 上游引物和下游引物 進(jìn)行AlTOR 5 和3 端序列的克 隆 5 端序列的克隆采用巢式PCR 第一輪反應(yīng)體系 10 PCR緩沖液5 0 L 25 mmol L 1 MgCl 2 3 0 L 10 mmol L 1 dNTP Mix 1 0 L 10 mol L 1 5 AlTOR 1 2 0 L 10 mol L 1 通用引物Abridged Anchor Primer 2 0 L cDNA 5 0 L Taq DNA聚合酶0 5 U 超純 水補(bǔ)足至50 0 L 第二輪反應(yīng)體系 10 PCR緩沖 液5 0 L 25 mmol L 1 MgCl 2 3 0 L 10 mmol L 1 dNTP Mix 1 0 L 10 mol L 1 5 AlTOR 2 1 0 L 10 mol L 1 通用引物Abridged Universal Amplification Primer 1 0 L 第一輪PCR產(chǎn)物5 0 L Taq DNA 聚合酶0 5 U 超純水補(bǔ)足至50 0 L PCR反應(yīng)條件 預(yù)變性94 2 min 94 30 s 55 30 s 72 1 min 循環(huán)35次 72 延伸7 min 3 端序列的克隆 也采用巢式PCR 第一輪反應(yīng)體系 PCR Grade Water 34 5 L 10 Advantage 2 PCR Buffer 5 0 L 10 mmol L 1 dNTP Mix 1 0 L 50 Advantage 2 Polymerase Mix 1 0 L cDNA 2 5 L 10 mol L 1 3 AlTOR 1 1 0 L 10 UPM 5 0 L 超純水補(bǔ)足至 50 0 L 第二輪反應(yīng)體系 PCR Grade Water 34 5 L 10 Advantage 2 PCR Buffer 5 0 L 10 mmol L 1 dNTP Mix 1 0 L 50 Advantage 2 Polymerase Mix 1 0 L 第一輪PCR產(chǎn)物2 5 L 10 mol L 1 3 AlTOR 2 1 0 L 10 UPM 5 0 L 超純水補(bǔ)足至 50 0 L PCR反應(yīng)條件 預(yù)變性94 2 min 94 30 s 68 30 s 72 1 min 循環(huán)30次 72 延伸7 min 將獲得的5 和3 端及保守區(qū)域進(jìn)行拼接和測(cè)序 上海生工生物工程有限公司 最終獲得AlTOR 全長(zhǎng) 最后根據(jù)測(cè)序結(jié)果 設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因克隆引物 AlTOR F和AlTOR R 進(jìn)行AlTOR全長(zhǎng)基因的 克隆 表 1 本研究所用的引物 Table 1 Primer sequences used in this study 引物名稱 目的 Primer name Purpose 序列 Primer sequence 5 to 3 克隆Cloning 5 AlTOR 1 AACGACTGGGCAAGAA 5 AlTOR 2 CAAGACGTTTGGGTAGCA 3 AlTOR 1 AGAGACTCAGTCGCTCACTATCAAGA 3 AlTOR 2 CATTGAGACCACACCCCAGACACA AlTOR F ATGGTGGAAAAATATGCTCG AlTOR R GCTAGCCAGTATACAACG 表達(dá)譜分析qRT PCR RT AlTOR F GGGGTCGTCAACTGGCAGAA RT AlTOR R CCTCCTTCTTCTTGGGTGCGA Al Actin F ACCTGTACGCCAACACCGT Al Actin R TGGAGAGAGAGGCGAGGAT 10期 譚永安等 綠盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆 抗體制備及在蛻皮激素誘導(dǎo)下的應(yīng)答 2121 1 4 AlTOR 時(shí)空表達(dá)定量檢測(cè) 收集綠盲蝽不同日齡若蟲及羽化7 d后雌成蟲的 不同組織 頭 胸 翅 足 中腸 卵巢和脂肪體 其中不同日齡樣本每個(gè)處理15頭 不同組織樣本每個(gè) 處理10頭雌成蟲 并設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù) 每個(gè)生物 學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù) 液氮處理樣品后 80 冰箱 保存?zhèn)溆?Trizol法提取總RNA Prime Script TM RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 20 保存 qRT PCR 試驗(yàn)步驟按照SYBR Premix Ex Taq Kit說(shuō)明書上進(jìn) 行 所用的AlTOR引物參見表1 并以綠盲蝽持家基 因 actin為內(nèi)標(biāo)對(duì)照基因 20 GenBank登錄號(hào) JN616391 擴(kuò)增體系 UltraSYBR Mix 12 5 L 上 下游引物各0 5 L cDNA模板2 L ddH 2 O 9 5 L 擴(kuò)增條件 95 預(yù)變性5 min 然后95 10 s 60 20 s 72 20 s 循環(huán)40次 1 5 20E 處理綠盲蝽若蟲 分別用20E 2 mol L 1 U73122 20E抑制劑 21 50 mol L 1 20E U73122處理 乙醇 CK 浸泡 切除兩端的四季豆1 min 晾干后飼喂初孵1齡若蟲 每處理綠盲蝽400頭 重復(fù)4次 按1 4方法收集綠 盲蝽不同發(fā)育階段和不同組織樣本后 分析不同處理 AlTOR表達(dá)量 1 6 AlTOR 序列分析與進(jìn)化樹分析 AlTOR核苷酸序列分析使用Expasy在線程序 http web expasy org compute pi 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析 蛋白結(jié)構(gòu)域分析運(yùn)用SMART在線分析 http smart embl heidelberg de 氨基酸序列比對(duì)軟件使用 ClustalX進(jìn)行 利用MEGA 6 0軟件包中的鄰接法 neighbor joining NJ 構(gòu)建進(jìn)化樹 并1 000次重 復(fù)構(gòu)建 1 7 AlTOR 在大腸桿菌中的表達(dá) 使用DNASTAR Protean軟件分析AlTOR蛋白 Antigenic index 選取抗原性較好的區(qū)域 72 381 蛋白質(zhì)理論分子量為35 83 kD 作為免疫原區(qū)域 使 用原核表達(dá)獲得抗原蛋白 基于PAS PCR based accurate synthesis 的方法 在引物的兩端各設(shè)計(jì)保護(hù) 性堿基合成基因6731 2S 將其連入pCzn1重組質(zhì)粒 用限制性內(nèi)切酶EcoR I及Xho I雙酶切后進(jìn)行連接 酶切體系 兩種限制性內(nèi)切酶各0 25 L 10 Buffer 緩沖液1 0 L 帶有合適酶切位點(diǎn)的基因片段3 L 用ddH 2 O補(bǔ)足至10 L 37 水浴3 h 連接體系 酶 切回收后的載體5 0 L 基因片段10 0 L T4 DNA 連接酶1 0 L 10 Buffer緩沖液2 0 L 用ddH 2 O 補(bǔ)足至20 L 16 反應(yīng)12 16 h 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10后采用PCR篩選 陽(yáng)性克隆 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pCzn1 AlTOR轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌Arctic Express感受態(tài)細(xì)胞 具體方法 將 質(zhì)粒1 L加入100 L感受態(tài)細(xì)菌中 置冰上20 min 42 熱激90 s 迅速置冰中5 min 加入600 L LB培 養(yǎng)液 37 220 r min振搖1 h 離心后全部涂布于 含50 g mL 1 Amp的LB平板 37 倒置培養(yǎng)過(guò)夜 挑取轉(zhuǎn)化平板上的多克隆接種于含50 g mL 1 Amp的 3 mL LB培養(yǎng)液的試管中 37 220 r min振搖過(guò)夜 次日按1 100接種于50 g mL 1 Amp的30 mL LB培 養(yǎng)液中 37 220 r min 振搖至菌體OD 600 為0 6 0 8 取出1 mL培養(yǎng)物 10 000 r min室溫離心2 min 棄上清 用100 L 1 上樣緩沖液重懸菌體沉淀 向 剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0 5 mmol L 1 20 220 r min振搖過(guò)夜 誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá) 取出1 mL培養(yǎng)物 10 000 r min室溫離心2 min 棄上清 用100 L 1 上樣緩沖液重懸菌體沉淀 剩余培養(yǎng)物 4 000 r min 離心10 min 棄上清 用PBS重懸菌體 沉淀 重懸液進(jìn)行超聲波破碎后 分別取上清液與沉 淀液加入上樣緩沖液重懸 12 SDS PAGE檢測(cè)分析 考馬斯亮藍(lán)染色顯帶 1 8 包涵體蛋白的變性和復(fù)性 先將菌體沉淀重懸于20 mL裂解液 20 mmol L 1 Tris HCl containing 1 mmol L 1 PMSF pH 8 0 中 超 聲破碎 功率400 W 工作4 s 間歇8 s 共20 min 收集沉淀 使用包涵體洗滌液 20 mmol L 1 Tris 1 mmol L 1 EDTA 2 mol L 1 尿素 1 mol L 1 NaCl 1 Triton X 100 pH 8 0 洗滌包涵體3次 再使用溶解 緩沖液 20 mmol L 1 Tris 5 mmol L 1 DTT 8 mol L 1 尿素 pH 8 0 溶解包涵體 4 過(guò)夜 室溫 10 000 r min離心15 min 將上述溶液滴加緩沖液 20 mmol L 1 Tris HCl 0 15 mol L 1 NaCl pH 8 0 逐 步成倍梯度稀釋緩慢攪拌 將蛋白溶液裝入透析袋于 上述緩沖液中透析過(guò)夜 1 9 融合蛋白的 Ni 柱親和純化 利用低壓層析系統(tǒng) 包涵體溶液以0 5 mL min 1 流速上樣至Ni IDA Binding Buffer預(yù)平衡的Ni IDA Sepharose CL 6B親和層析柱 Ni IDA Binding Buffer 以0 5 mL min 1 流速?zèng)_洗 至流出液OD 280 值到達(dá)基 線 再用Ni IDA Washing Buffer 20 mmol L 1 Tris HCl 20 mmol L 1 咪唑 0 15 mol L 1 NaCl pH 8 0 以1 mL min 1 流速?zèng)_洗 至流出液OD 280 值到達(dá)基線 2122 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 54卷 用Ni IDA Elution Buffer 20 mmol L 1 Tris HCl 250 mmol L 1 咪唑 0 15 mol L 1 NaCl pH 8 0 以1 mL min 1 流速洗脫目的蛋白 收集流出液 上述收集的蛋白溶 液加入透析袋中 使用Ni IDA Elution Buffer進(jìn)行透 析過(guò)夜 12 SDS PAGE分析后利用BSA蛋白定量 試劑盒測(cè)定蛋白濃度 1 10 AlTOR 多克隆抗體的制備 取純化的AlTOR重組蛋白免疫新西蘭白兔 江 蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供 皮下注射 每次 免疫量為400 g 2 3周免疫一次 共免疫4次 第 4次免疫后在大白兔頸動(dòng)脈采血 8 000 r min離心8 min所得上清制備抗血清并準(zhǔn)備純化抗體 TOR蛋白 與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱 將 PBS與所得抗血清等量混合后緩慢上樣 待抗體抗原 結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫得到所需純化抗體 并在PBS緩沖液 pH 7 4 中進(jìn)行透析過(guò)夜 4 隔日進(jìn)行效價(jià)測(cè)定 BCA濃度測(cè)定試劑盒對(duì)所得抗體 進(jìn)行濃度測(cè)定 1 11 效價(jià)測(cè)定 間接ELISA法對(duì)抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定 以純化的 AlTOR重組蛋白 5 g mL 1 包被ELISA板 每孔加 入100 mL 4 過(guò)夜 用PBST 0 2 g KCl 0 2 g KH 2 PO 4 2 9 g NaHPO 4 12H 2 O 8 g NaC1 0 05 Tween 20 pH 7 4 洗滌3次 加入PBST封閉液 含 5 牛血清白蛋白 于37 封閉2 h 取出酶標(biāo)板 棄 去內(nèi)液 用PBST洗板3次 加入用PBST連續(xù)倍比 稀釋的AlTOR多克隆抗體和陰性血清每孔100 L 37 恒溫箱1 h 同上洗滌后 加入100 L的用PBST 以1 5 000稀釋的二抗HRP IgG 37 放置1 h 用 PBST洗板3次 每次5 min 最后加100 L TMB底 物液顯色 37 顯色15 min 待終止反應(yīng)后 酶標(biāo)儀 測(cè)定A 450 值 1 12 AlTOR 多克隆抗體的鑒定 檢測(cè)多克隆抗體的特異性Western blot測(cè)定按照 SONG等 22 的方法進(jìn)行并稍作修改 將原核表達(dá)的 AlTOR重組蛋白及3齡綠盲蝽若蟲總蛋白進(jìn)行 SDS PAGE分析 轉(zhuǎn)印PVDF膜后封閉 一抗為上述 制備的蛋白抗體 二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗 鼠HRP 1 13 數(shù)據(jù)分析 不同處理的AlTOR相對(duì)表達(dá)量變化以2 Ct 23 計(jì) 算 差異顯著性采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8 0中的Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行分析 2 結(jié)果 2 1 AlTOR 的克隆及序列分析 利用綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組篩選AlTOR基因序列 再利 用RACE方法 分別進(jìn)行5 和3 末端的擴(kuò)增 獲得 了AlTOR的全長(zhǎng)序列 圖1 序列分析結(jié)果表明 AlTOR全長(zhǎng)1 652 bp 包括一個(gè)208 bp的5 非翻譯區(qū) 以及136 bp的3 端非翻譯區(qū) AlTOR開放閱讀框含有 1 308 bp的核苷酸 編碼435個(gè)氨基酸 理論等電點(diǎn) 預(yù)測(cè)為7 16 結(jié)構(gòu)域分析表明 AlTOR基因翻譯后的 氨基酸序列具有典型的TOR特征 含有N 末端的 SIN1結(jié)構(gòu)域 288 bp 高度保守的CRIM結(jié)構(gòu)域 390 bp 及脂質(zhì)與膜結(jié)合相關(guān)C 末端的PH域 363 bp 圖2 2 2 多重聯(lián)比及進(jìn)化樹分析 多重聯(lián)比結(jié)果如圖3所示 TOR在半翅目昆蟲中 較為保守 尤其是CRIM結(jié)構(gòu)域 AlTOR的氨基酸序 列與半翅目臭蟲科溫帶臭蟲 Cimex lectularius 以及 蝽科茶翅蝽 Halyomorpha halys 的TOR氨基酸序列 一致性相對(duì)較高 分別為55 78 和54 38 與其他 昆蟲的TOR基因序列一致性較低 如膜翅目的造紙胡 蜂 Polistes dominula 38 70 及蕪菁葉蜂 Athalia rosae 39 33 AB C 2000 bp 1500 1000 750 500 300 150 50 MM M M321 A 5 端5 end B 3 端3 end C 全長(zhǎng)Full sequence M DL2000 1 5 端第二輪PCR產(chǎn)物The second round of 5 PCR product 2 3 端第 二輪PCR產(chǎn)物The second round of 3 PCR product 3 全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物 Full sequence of PCR product 圖 1 AlTOR 的5 3 端及全長(zhǎng)序列 PCR 產(chǎn)物 Fig 1 PCR products of 5 3 end and full sequences from AlTOR 10期 譚永安等 綠盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆 抗體制備及在蛻皮激素誘導(dǎo)下的應(yīng)答 2123 1 ATG TGT GAG GTG GTG ATG ACG TGT GAC AAT GTT GCA CGT CAA ATA CCA GTG GGA AAA TAT M C E V V M T C D N V A R Q I P V G K Y 21 GAC TGC TAC CCA AAC GTC TTG GAG GAG GAG GAG GAA GAT GCC ATT CTT GCC CAG TCG TTT D C Y P N V L E E E E E D A I L A Q S F 41 GAC ATC AAT TCG GAT TTG CAA TTC GGT CTC AGG AGA CCG AAA GCG CGG ATG GAG AGG GCG D I N S D L Q F G L R R P K A R M E R A 61 GTC AGC ACG GAG AAA AAG AAA GCG ATC AAG TCG AAA AAC ATC AAG TGG ACC AAC CCT TCC V S T E K K K A I K S K N I K W T N P S 81 CGT CTT CTA TCC AAT GAC GAA CTG AAC GTG TTC TTC CCG CAT AAG GAC CTT GAA CTA ACC R L L S N D E L N V F F P H K D L E L T 101 AGG AAG GAG AAC GCC GGA AAA AGG GTG TCA CTC CTC ACT GAG CTC CTC GCC AAG TAT CCA R K E N A G K R V S L L T E L L A K Y P 121 AAT CAG CCC GAT AAC CCT TTC AAA GAC TAT GCC AAA CTC GAT GGC AAT GCG CAG GTT GGT N Q P D N P F K D Y A K L D G N A Q V G 141 GTT CCT ATT AAA AAA TAT AGA ATT TAC GTT ACT ATG CTG CCA GAG GAA ATT CAG AAG TTC V P I K K Y R I Y V T M L P E E I Q K F 161 CCC ATG GAA GTT ACG ATT GTA GCG TCA GCG AAA GTC AGT GAT CTA ATC GGT CTC ATT TGT P M E V T I V A S A K V S D L I G L I C 181 TGG AAA TGT TCA ACC GAG TTC ACG GAT GTC TCT TTA AAG GAC AGC GCG AGT AAC TAT AGT W K C S T E F T D V S L K D S A S N Y S 201 CTG TAC ATA GCT GAA GAT GAT GGT GAC GTT GAC TGG GAC TTT CCT TGT CTC GAC TCC CGG L Y I A E D D G D V D W D F P C L D S R 221 GAA ATT ATT AAC AAG TTT GGT TTT TCC TAC CTC GCA ATC GTT GAT AGA GAC TCA GTC GCT E I I N K F G F S Y L A I V D R D S V A 241 CAC TAT CAA GAT GAA TCA TAT CCT CTA GTC ATT GAG ACC ACA CCC CAG ACA CAC GAG CCA H Y Q D E S Y P L V I E T T P Q T H E P 261 CCA TCA TCA ATT AGA GAC CGA GTA CAG AGG AAC TGG GAC GCG AGG ATT ATG AGG GGA CAA P S S I R D R V Q R N W D A R I M R G Q 281 ATG GAC GCC CTG GAG GCA CCT TTG TTC CAG TCG TTT TGT GTC TTT TTA CTA AAC AGG ATC M D A L E A P L F Q S F C V F L L N R I 301 CGC GTC AGG ACT GAA GTA TAC CTA GAA ATT TC