中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) ChineseAgriculturalScienceBulletin 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 2021 37 16 51 58 ChineseAgriculturalScienceBulletin 基 金 項(xiàng) 目 國(guó) 家 自 然 基 金 內(nèi) 生 菌 促 進(jìn) 滇 重 樓 皂 苷 類 活 性 成 分 積 累 的 機(jī) 理 研 究 81473310 國(guó) 家 自 然 基 金 滇 重 樓 結(jié) 構(gòu) 發(fā) 育 與 皂 苷 積 累 的 光 照 效 應(yīng) 31560085 第 一 作 者 簡(jiǎn) 介 徐 若 女 1995 年 出 生 云 南 宣 威 人 學(xué) 士 研 究 方 向 植 物 學(xué) 通 信 地 址 650051 云 南 省 昆 明 市 盤 龍 區(qū) 云 南 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) E mail 907689386 通 訊 作 者 劉 濤 男 1978 年 出 生 河 南 洛 陽(yáng) 人 教 授 博 士 研 究 方 向 分 子 生 物 學(xué) 藥 用 植 物 學(xué) 通 信 地 址 650051 云 南 省 昆 明 市 盤 龍 區(qū) 云 南 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) E mail 52133490 收稿日期 2019 09 09 修回日期 2021 03 19 干旱脅迫對(duì)三七生理指標(biāo)的影響及轉(zhuǎn)錄組分析 徐 若 1 張秀芬 1 李艷冰 2 字淑慧 1 2 楊生超 1 劉 濤 1 1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 昆明650201 2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 昆明650201 摘 要 為 揭 示 干 旱 脅 迫 下 三 七 的 生 理 特 性 和 基 因 轉(zhuǎn) 錄 組 變 化 通 過(guò) 干 旱 條 件 和 正 常 澆 水 控 制 研 究 干 旱 對(duì)于三七的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置自然干旱和正常澆 水 對(duì)照 處理 分別測(cè)定三七葉片的葉綠素 含量 可溶性 蛋 白 含 量 POD 活 性 SOD 活 性 CAT 活 性 和MDA 活 性 并 從 三 七 葉 片 中 提 取RNA 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 分 析 結(jié) 果 顯 示 干 旱 脅 迫 下 三 七M(jìn)DA 變 化 非 常 明 顯 與 對(duì) 照 相 比 植 株 受 到 干 旱 后 的MDA 活 性 升 高 了 88 41 相 反CAT 活 性 受 干 旱 影 響 的 效 果 不 明 顯 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 結(jié) 果 表 明 與 對(duì) 照 相 比 干 旱 處 理 樣 品 上 調(diào) 基 因431 個(gè) 下 調(diào) 基 因151 個(gè) 對(duì) 差 異 基 因 進(jìn) 行GO 注 釋 和 功 能 富 集 性 分 析 有160 個(gè) 上 調(diào) 基 因 和53 個(gè) 下 調(diào) 基 因 共213 個(gè) 差 異 基 因 注 釋 到 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 KEGG 分 析 結(jié) 果 表 明 有122 個(gè)DEGs 在37 個(gè) 代 謝 通 路 上 ABA 合 成 代 謝 的 關(guān) 鍵 酶 9 順 式 環(huán) 氧 類 胡 蘿 卜 素 雙 加 氧 酶 被 顯 著 富 集 說(shuō) 明 干 旱 條 件 下 三 七 可 能 通過(guò)ABA 相關(guān)合成酶的增加調(diào)控干旱應(yīng)答 關(guān)鍵詞 三七 干旱 生理特性分析 轉(zhuǎn)錄組分析 脫落酸 中圖分類號(hào) Q945 78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 論文編號(hào) casb20190900619 Effects of Drought Stress on Physiological Indexes of Panax notoginseng and Transcriptome Analysis Xu Ruo 1 Zhang Xiufen 1 Li Yanbing 2 Zi Shuhui 1 2 Yang Shengchao 1 Liu Tao 1 1 Yunnan Agricultural University National and Local Joint Engineering Research Center for Germplasm Innovation and Utilization of Southwest Chinese Medicinal Materials Kunming 650201 2 College of Agronomy and Biotechnology Yunnan Agricultural University Kunming 650201 Abstract To reveal the physiological characteristics and gene transcriptome changes of Panax notoginseng under drought stress we studied the effects of drought on P notoginseng through drought conditions and normal watering control The chlorophyll content soluble protein content POD activity SOD activity CAT activity and MDA activity of P notoginseng leaves were measured respectively and RNA was extracted from P notoginseng leaves for transcriptome sequencing analysis The results show that the change of MDA in P notoginseng is very obvious under drought stress Compared with the control the MDA activity of the plant increases by 88 41 after drought on the contrary the effect of CAT activity affected by drought is not obvious The results of transcriptome analysis show that there are 431 up regulated genes and 151 down regulated genes in the drought treated samples compared with the control GO annotation and functional enrichment analysis were carried out on the differential genes There are 160 up regulated genes and 53 down regulated genes with 213 differential gene annotations in the database KEGG analysis shows that there are 122 DE Gs in 37 metabolic pathways 9 cis cyclocarotenoid dioxygenase the key enzyme of ABA anabolism is中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 0 引言 三 七 Panax notoginseng 為 五 加 科 Araliaceae 人 參 屬 Panax 植 物 三 七 可 整 株 入 藥 除 可 活 血 化 瘀 清腫止痛 滋補(bǔ)強(qiáng)壯 補(bǔ)血造血外 還具有抗疲勞 抗衰 老 抗 炎 抗 腫 瘤 降 血 壓 降 血 脂 降 血 糖 等 多 方 面 的 藥 理 作 用 在 藥 品 和 天 然 保 健 品 方 面 有 著 重 要 開 發(fā) 價(jià) 值 1 三 七 在 廣 西 貴 州 四 川 云 南 種 植 較 多 是 重 要 名貴藥用植物 2 在臨床上具有較高的利用價(jià)值 3 干旱脅迫是限制作物生產(chǎn)和大幅度降低產(chǎn)量的最 重 要 的 非 生 物 脅 迫 4 21 世 紀(jì) 以 來(lái) 中 國(guó) 每 年 都 會(huì) 發(fā) 生 干 旱 云 南 地 區(qū) 是 國(guó) 內(nèi) 干 旱 較 頻 繁 發(fā) 生 的 地 區(qū) 之 一 有 十年九旱 之說(shuō) 干旱脅迫所導(dǎo)致的作物減產(chǎn)超 過(guò)其他環(huán)境脅迫所造成減產(chǎn)的總和 干旱嚴(yán)重影響植 物 的 生 長(zhǎng) 威 脅 植 物 的 生 存 5 降 低 植 物 光 合 速 率 以 及 葉綠體對(duì)光能的吸收能力和轉(zhuǎn)能效率 然而植物面對(duì) 干 旱 的 環(huán) 境 不 是 完 全 被 動(dòng) 的 6 在 長(zhǎng) 期 的 適 應(yīng) 和 馴 化 過(guò)程中 當(dāng)受到生物和非生物脅迫的嚴(yán)重影響時(shí) 植物 已 經(jīng) 進(jìn) 化 出 一 些 有 效 的 機(jī) 制 應(yīng) 對(duì) 環(huán) 境 挑 戰(zhàn) 對(duì) 干 旱 脅 迫 也 產(chǎn) 生 了 不 同 的 生 理 生 化 策 略 7 在 干 旱 脅 迫 條 件 下 各 種 小 分 子 如 脯 氨 酸 可 溶 性 糖 可 溶 性 蛋 白 等 在 滲 透 調(diào) 節(jié) 中 起 重 要 作 用 迅 速 積 累 起 來(lái) 8 此 外 超 氧 化 物 歧 化 酶 SOD 過(guò) 氧 化 物 酶 POD 過(guò) 氧 化 氫 酶 CAT 等 抗 氧 化 酶 以 及MDA 含 量 也 被 迅 速 誘 導(dǎo) 以 應(yīng) 對(duì) 干 旱 脅 迫 期 間 的 氧 化 損 傷 這 些 分 子 的 含 量 和 這 些 酶的活性被廣泛地用作評(píng)價(jià)植物在遭受干旱時(shí)的特性 的 參 數(shù) 9 與 根 莖 相 比 植 物 葉 片 對(duì) 環(huán) 境 變 化 更 為 敏 感 當(dāng)空氣的蒸汽壓和相對(duì)濕度等發(fā)生變化時(shí) 植物會(huì) 迅速關(guān)閉氣孔 減少水分損失 同時(shí)保持較高的水分利 用 效 率 趙 宏 光 10 通 過(guò) 對(duì) 三 七 葉 片 的 研 究 發(fā) 現(xiàn) 三 七 葉片能夠通過(guò)保護(hù)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來(lái)適應(yīng) 土 壤 水 分 含 量 的 變 化 但 是 三 七 葉 片 酶 活 性 和 調(diào) 節(jié) 物質(zhì)對(duì)干旱的響應(yīng)程度如何目前尚未見報(bào)道 植物在生長(zhǎng)過(guò)程中不可避免地經(jīng)歷各種非生物脅 迫 為適應(yīng)環(huán)境的變化 植物會(huì)調(diào)節(jié)一些基因的表達(dá) 產(chǎn) 生 新 的 蛋 白 質(zhì) 11 同 時(shí) 在 生 理 和 生 化 水 平 上 發(fā) 生 顯 著 變 化 干 旱 是 最 常 見 的 非 生 物 脅 迫 之 一 植 物 在 干 旱的環(huán)境下 不僅在生理水平產(chǎn)生對(duì)環(huán)境的抵抗 在生 化水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化 三七受到干旱脅迫是多 基因控制的數(shù)量性狀 與植株外部的形態(tài)建成 滲透調(diào) 節(jié)能力 抗氧化能力等存在密切關(guān)系 然而 在三七干 旱脅迫下 這些分子化合物 酶活性的動(dòng)態(tài)變化以及生 化水平的響應(yīng)很大程度上尚不清楚 筆者從生理水平的響應(yīng)和生化水平對(duì)三七的抗旱 性機(jī)制進(jìn)行研究 系統(tǒng)分析三七的抗旱響應(yīng)機(jī)制 以期 為進(jìn)一步深入研究三七干旱脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供依據(jù) 1 材料與方法 1 1 供試材料 實(shí) 驗(yàn) 苗 均 選 用 來(lái) 自 同 一 地 方 苗 齡 為1 年 生 長(zhǎng) 勢(shì) 基本一致的健康三七苗 供試材料由三七道地產(chǎn)區(qū)云 南 省 文 山 州 硯 山 縣 種 植 基 地 東 經(jīng)103 35 104 45 北緯23 18 23 59 之間 海拔1539m 提供 1 2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2017 年7 月 中 旬 從 云 南 省 文 山 州 硯 山 縣 三 七 種 植基地采挖一年生三七苗 當(dāng)天及時(shí)將采挖好的三七 苗 采 用 盆 栽 的 方 式 移 栽 于 云 南 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 后 山 大 棚 東 經(jīng)105 45 北 緯25 7 海 拔1960 m 盆 栽 種 植 時(shí) 每 個(gè) 花 盆 26cm 21cm 裝 有 機(jī) 土 與 黃 壤 土 比 例2 1 的 混 勻土2kg 每盆10 株三七 8 月5 日挑選出生長(zhǎng)情況一 致 的 盆 栽 三 七 苗 進(jìn) 行 正 式 實(shí) 驗(yàn) 處 理 實(shí) 驗(yàn) 分 為2 組 處 理 自 然 干 旱 處 理6 盆 3 個(gè) 重 復(fù) 每 個(gè) 重 復(fù)2 盆 對(duì) 照 處 理6 盆 3 個(gè) 重 復(fù) 每 個(gè) 重 復(fù)2 盆 實(shí) 驗(yàn) 觀 測(cè) 前 統(tǒng) 一 灌 溉2 組 處 理 的 實(shí) 驗(yàn) 苗 并 計(jì) 算 最 大 含 水 量 作 為100 的 土 壤 相 對(duì) 含 水 量 RWC 干 旱 處 理 組 不 再 澆 水 直 至 自 然 干 旱 對(duì) 照 組 每 天 檢 測(cè) 土 壤 RWC 根 據(jù) RWC 值 適 當(dāng) 補(bǔ) 水 保 證 土 壤 相 對(duì) 含 水 量 RWC 維 持 在 同 一 水 平 約2 天 澆 一 次 水 每 次 每 盆 澆100 200 mL 培 養(yǎng) 45 天 后 自 然 干 旱 處 理 組 已 經(jīng) 出 現(xiàn)80 萎 焉 程 度 每 個(gè) 處 理 取 一 片 葉 蒸 餾 水 沖 洗 表 面 雜 質(zhì) 去 除 葉 脈 弱 光 條 件 研 磨 檢 測(cè) 葉 綠 素 含 量 取0 1 g 葉 片 冰 浴 研 磨 檢 測(cè) 超 氧 化 物 歧 化 酶 SOD 活 性 過(guò) 氧 化 物 酶 POD 活 性 過(guò) 氧 化 氫 酶 CAT 活 性 以 及 丙 二 醛 MDA 含 量 取0 1g 三 七 葉 片 根 據(jù)TRN20l A 總RNA 提 取 說(shuō)明書方法提取RNA 1 3 實(shí)驗(yàn)方法 1 3 1 生 理 指 標(biāo) 測(cè) 定 超 氧 化 物 歧 化 酶 SOD 活 性 測(cè) 定 采 用WST 1 法 過(guò) 氧 化 物 酶 POD 活 性 測(cè) 定 采 用 比 色 法 過(guò) 氧 化 氫 酶 CAT 活 性 測(cè) 定 采 用 可 見 光 法 丙 二 醛 MDA 含 量 測(cè) 定 采 用TBA 法 葉 綠 素 含 量 的 測(cè) 定 方 法 借 鑒Arnon 法 12 試 劑 盒 均 購(gòu) 買 自 南 京 建 成 生 物 科 技 有 限 公 司 TRN20l A 總RNA 提 取 試 劑 盒 購(gòu) 買 自 天 根 significantly enriched indicating that P notoginseng may regulate drought response through the increase of ABA related synthase Keywords Panax notoginseng drought physiological characteristic analysis transcriptome analysis ABA 52生化科技有限公司 1 3 2 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 組 裝 以 及 基 因 注 釋 分 別 將 干 旱 處 理 樣 品 和 對(duì) 照 樣 品 各 自 分 別 混 合 并 保 證 混 合 后 樣 品 質(zhì)量相等 由北京百邁克生物科技有限公司構(gòu)建文庫(kù) 文 庫(kù) 質(zhì) 量 檢 測(cè) 合 格 后 安 排 上 機(jī) 測(cè) 序 使 用IIIumina Hiseq 高 通 量 測(cè) 序 平 臺(tái) 對(duì)cDNA 進(jìn) 行 測(cè) 序 在 進(jìn) 行 后 續(xù) 分 析 之 前 首 先 需 要 確 保 所 用Reads 有 足 夠 高 的 質(zhì) 量 以 保 證 序 列 組 裝 和 后 續(xù) 分 析 的 準(zhǔn) 確 由 測(cè) 序 儀 造 成 的 錯(cuò) 誤 率 小 于0 1 的 堿 基 所 占 比 例 Q30 來(lái) 衡 量 測(cè) 序 的 質(zhì) 量 對(duì)RawData 進(jìn) 行 數(shù) 據(jù) 過(guò) 濾 13 去 除 其 中 的 接 頭 序 列 及 低 質(zhì) 量Reads 獲 得 高 質(zhì) 量 的Clean Data 使 用BLAST 軟 件 將Unigene 序 列 與Nr Swiss Prot GO gene ontology COG cluster of orthologous groups KOG eggNOG KEGG Kyoto encyclopedia of genes and genomes 和Pfam 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 比 對(duì) 臨 界 值 為 E 10 5 進(jìn) 行功能注釋分析 1 3 3 差 異 基 因 篩 選 及 富 集 分 析 使 用EBSeq 進(jìn) 行 差 異 表 達(dá) 分 析 獲 得 干 旱 處 理 組 和 對(duì) 照 組 之 間 的 差 異 表 達(dá) 基 因 集 使 用RPKM 法 reads perkb per million reads 計(jì) 算Unigene 表 達(dá) 量 統(tǒng) 計(jì) 干 旱 和 對(duì) 照 的 基 因 表 達(dá) 豐 度 在 篩 選 過(guò) 程 中 將 FDR 0 01 且 差 異 倍 數(shù) FC 2 作 為 篩選標(biāo)準(zhǔn) FDR 值越低表 明基因表 達(dá)差異越 顯著 篩選 出 log2 Ratio 1 和 q 0 05 的 基 因 作 為 DEGs 對(duì) DEGs 做GO 功 能 分 析 和KEGG 途 徑 分 析 2 結(jié)果與分析 2 1 干 旱 脅 迫 對(duì) 三 七 葉 片 葉 綠 素 可 溶 性 蛋 白 含 量 的 影響 植物葉綠素含量的高低影響著植物光合作用的速 率 和 光 合 產(chǎn) 物 的 形 成 是 反 映 植 物 光 合 能 力 的 重 要 指 標(biāo)之一 通常認(rèn)為水分脅迫會(huì)降低葉綠素含量 如圖 1 所 示 干 旱 脅 迫 下 三 七 葉 綠 素 含 量 發(fā) 生 變 化 SPSS 方 差 分 析 表 明 處 理 組 和 對(duì) 照 組 的 葉 綠 素 含 量 差 異 均 達(dá) 顯 著 水 平 P 0 05 與 對(duì) 照 相 比 處 理 組 葉 綠 素a 葉 綠 素b 葉 綠 素a b 總 葉 綠 素 以 及 類 胡 蘿 卜 素 顯 著 高 于 對(duì) 照 葉 綠 素a b 比 對(duì) 照 高 出2 97 總 葉 綠 素 含 量 約高出對(duì)照39 8 2 2 干旱脅迫對(duì)三七葉片可溶性蛋白含量的影響 可 溶 性 蛋 白 是 重 要 的 滲 透 調(diào) 節(jié) 物 質(zhì) 和 營(yíng) 養(yǎng) 物 質(zhì) 它 們 的 增 加 和 積 累 能 提 高 細(xì) 胞 的 保 水 能 力 對(duì) 細(xì) 胞 的 生 命 物 質(zhì) 及 生 物 膜 起 到 保 護(hù) 作 用 因 此 經(jīng) 常 用 作 抗 性 篩 選 指 標(biāo) 在 此 次 研 究 中 處 理 組 可 溶 性 蛋 白 略 高 于 對(duì) 照 組 處 理 組 可 溶 性 蛋 白 含 量 高 于 對(duì) 照 組 約3 7 圖2 2 3 干旱脅迫下三七葉片POD 和SOD 的變化情況 當(dāng) 植 物 遭 受 干 旱 脅 迫 時(shí) POD 和SOD 會(huì) 發(fā) 生 變 化 以 維 持 體 內(nèi) 活 性 氧 代 謝 的 動(dòng) 態(tài) 平 衡 圖3 方 差 分 析 結(jié) 果 顯 示 2 組 處 理 間POD 活 性 和SOD 活 性 差 異 均 達(dá) 顯 著 水 平 P 0 05 處 理 組 三 七 葉 片 的POD 活 性 和 SOD 活 性 分 別 高 于 對(duì) 照79 19 9 05 受 干 旱 影 響 敏感度POD 活性大于SOD 活性 圖 1 不同處理的三七葉片葉綠素含量 圖 2 不同處理的三七葉片可溶性蛋白含量 葉 綠 素 葉 綠 素 總 葉 綠 素 葉 綠 素 類 胡 蘿 卜 素 葉 綠 素 葉 綠 素 含 量 處 理 對(duì) 照 處 理 對(duì) 照 可 溶 蛋 白 含 量 圖 3 不同處理的三七葉片 POD 活性和 SOD 活性 活 性 處 理 對(duì) 照 徐 若 等 干 旱 脅 迫 對(duì) 三 七 生 理 指 標(biāo) 的 影 響 及 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 53中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 2 4 干旱脅迫下三七葉片CAT 活性的變化情況 CAT 是 催 化 過(guò) 氧 化 氫 分 解 成 氧 和 水 的 酶 存 在 于 細(xì) 胞 的 過(guò) 氧 化 物 體 內(nèi) 能 將 逆 境 脅 迫 下 細(xì) 胞 內(nèi) 產(chǎn) 生 的 H2O2 分 解 維 持 膜 系 統(tǒng) 的 穩(wěn) 定 性 圖4 表 明 CAT 活 性 與 植 物 的 抗 逆 性 有 關(guān) 在 本 次 研 究 中 CAT 活 性 在 干 旱脅迫和對(duì)照中的活性都較低 但是相較于對(duì)照 處理 組的CAT 活性有所升高 2 5 干旱脅迫下三七葉片MDA 含量的變化情況 由 圖 5 可 知 與 對(duì) 照 相 比 MDA 含 量 升 高 了 88 41 SPSS 方 差 分 析 結(jié) 果 表 明 干 旱 處 理 和 對(duì) 照 MDA 含量差異達(dá)顯著水平 P 0 05 2 6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量檢測(cè)和注釋數(shù)據(jù) 完 成2 個(gè) 樣 品 的 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 共 獲 得15 50 GB CleanData 51883034 個(gè)Cleanreads 各 樣 品 Q30 堿 基 百 分 比 均 不 小 于93 97 使 用Trinity 軟 件 組 裝 共 得 到 68134 條Unigene 其 中 長(zhǎng) 度 在1 kb 以 上 的Unigene 有 13544 條 Unigene 的 N50 為1180 組 裝 完 整 性 較 高 對(duì) Unigene 進(jìn) 行 功 能 注 釋 包 括 與 Nr Swiss Prot KEGG COG KOG GO 和Pfam 數(shù)據(jù) 庫(kù)的 比對(duì) 共獲 得 33151 條Unigene 51 34 的 注 釋 結(jié) 果 表1 由 表 可 知 在 所 有 注 釋 的 序 列 中 分 別 有32666 98 54 30306 91 42 19951 60 18 19380 58 46 19183 57 87 18414 55 55 11905 35 91 10005 30 18 個(gè) 序 列 在 Nr eggNOG Pfam GO Swiss Prot KOG KEGG COG 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)成功 2 7 COG 功能分類 COG 分 類 結(jié) 果 圖6 表 明 有10005 條 轉(zhuǎn) 錄 本 被 注 釋 到 該 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 包 含 了21 個(gè) 功 能 類 別 涵 蓋 基 因 最 多 的 是 一 般 功 能 預(yù) 測(cè) 24 93 其 次 是 復(fù) 制 重 組 和 修 復(fù) 12 55 翻 譯 核 糖 體 結(jié) 構(gòu) 與 生 物 合 生 11 93 轉(zhuǎn) 錄 10 98 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 機(jī) 制 9 00 氨 基 酸 轉(zhuǎn) 運(yùn) 與 代 謝 8 02 等 所 有 類 別 中 核 酸 結(jié) 構(gòu) 0 08 的 數(shù) 量 最 少 2 8 差異基因的GO 分類和富集分析 在GO 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 有19380 個(gè) 基 因 注 釋 到36 個(gè)GO 條 目 中 分 為 分 子 功 能 molecular function 細(xì) 胞 組 分 cellularcomponent 和 生 物 學(xué) 過(guò) 程 biologicalprocess 3 類 圖7 在 細(xì) 胞 組 分 類 型 中 細(xì) 胞 cell 和 細(xì) 胞 組 分 cellpart 最 顯 著 富 集 注 釋 的Unigene 數(shù) 均 為8636 占 總 注 釋 基 因 數(shù) 的44 56 催 化 活 性 catalytic activity 和 組 合 binding 在 分 子 功 能 類 型 中 最 為 富 集 注 釋 的 Unigene 數(shù) 分 別 為10510 9898 分 別 占 總 注 釋 基 因 數(shù) 的54 23 51 07 在 生 物 學(xué) 過(guò) 程 類 型 中 顯 著 富 集 的 是 代 謝 過(guò) 程 metabolic process 和 細(xì) 胞 過(guò) 程 cellular process 注 釋 的unigene 數(shù) 分 別 為13689 11696 分 別 占 總 注 釋 基 因 數(shù) 的70 63 60 35 催 化 活 性 代 謝 過(guò) 程 與 干 旱 脅 迫 密 切 相 關(guān) 以 FDR 0 01 和 log2 fold change 2 來(lái) 評(píng) 估 樣 本 間 的 差 異 基 因 定 義 為DEGs 共 圖 4 不同處理的三七葉片 CAT 活性 圖 5 不同處理的三七葉片 MDA 活性 處 理 對(duì) 照 處 理 對(duì) 照 表 1 三七葉片轉(zhuǎn)錄組 Unigene 注釋 數(shù)據(jù)庫(kù) COG GO KEGG KOG Pfam Swiss Prot EggNOG Nr All 注釋數(shù)目 10005 19380 11905 18414 19951 19183 30306 32666 33151 長(zhǎng)度300 1000bp 2737 6733 4372 6331 6277 7111 10951 11958 12087 長(zhǎng)度 1000bp 4524 7179 4614 7400 9640 8338 11524 11782 11808 54篩 選 出582 個(gè)DEGs 與CK 相 比 干 旱 處 理 樣 本 上 調(diào) 基 因431 個(gè) 下 調(diào) 基 因151 個(gè) 對(duì)DEGs 做GO 注 釋 和 功 能 富 集 性 分 析 有213 個(gè)DEGs 160 個(gè) 上 調(diào) 53 個(gè) 下 調(diào) 注釋到該數(shù)據(jù)庫(kù)中 2 9 DEGs 的KEGG 功能注釋分析 KEGG 分 析 結(jié) 果 表 明 共 有11905 個(gè)unigene 注 釋 到 該 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 對(duì)DEGs 中 顯 著 性 富 集 的Pathway 分 析 得 出 有122 個(gè)DEGs 在37 個(gè) 代 謝 通 路 上 表2 表 中 圖 6 葉片轉(zhuǎn)錄組 Unigene 序列 COG 功能注釋分類 圖 7 干旱脅迫差異基因 GO 功能注釋結(jié)果 徐 若 等 干 旱 脅 迫 對(duì) 三 七 生 理 指 標(biāo) 的 影 響 及 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 55中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 信息以富集顯著由大到小依次排列 與類胡蘿卜素生 物 合 成 相 關(guān) 的 基 因 包 括9 順 式 環(huán) 氧 類 胡 蘿 卜 素 雙 加 氧 酶 脫 落 酸8 羥 化 酶 紫 黃 質(zhì) 脫 環(huán) 氧 化 酶 硫 甙 生 物 合 成 相 關(guān) 的 基 因 包 括 酪 氨 酸 單 氧 酶 纈 氨 酸 單 加 氧 酶 植 物 激 素 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 相 關(guān) 的 基 因 包 括 生 長(zhǎng) 素 誘 導(dǎo) 蛋 白 生 長(zhǎng) 素 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白 蛋 白 磷 酸 酶 木 葡 聚 糖 內(nèi) 轉(zhuǎn) 葡 糖 基 酶 水 解 酶 蛋 白 脫 落 酸 受 體 等 這 些 途 徑 為 研 究 三 七 干 旱 脅 迫 的 具 體 過(guò) 程 功 能 和 途 徑 提 供 了 具 體 依 表 2 DEGs 富集的 37 條 KEGG 通路 代謝通路ID Ko00906 Ko00966 Ko00940 Ko04626 Ko04075 Ko00360 Ko00908 Ko00500 Ko00052 Ko00460 Ko00910 Ko00909 Ko00270 Ko00062 Ko01210 Ko00196 Ko03430 Ko00400 Ko03010 Ko03440 Ko00520 Ko00592 Ko00900 Ko03420 Ko03030 Ko01040 Ko00040 Ko00071 Ko00480 Ko00190 Ko04146 Ko00240 Ko01212 Ko04141 Ko03013 Ko01230 Ko03040 注釋到該通路的差異基因 5 2 7 7 8 5 2 6 3 2 2 1 3 1 2 1 1 1 7 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 2 1 注釋到該通路的所有基因 43 2 149 193 262 106 20 250 91 55 61 18 163 27 116 47 53 60 642 63 178 81 85 85 87 93 94 126 127 316 180 185 188 263 281 472 322 代謝通路注釋 類胡蘿卜素生物合成 硫甙生物合成 苯丙素生物合成 植物 病原體相互作用 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 苯丙氨酸代謝 玉米素生物合成 淀粉和蔗糖代謝 半乳糖代謝 氰氨基酸代謝 氮代謝 倍半萜類和三萜類生物合成 半胱氨酸和蛋氨酸代謝 脂肪酸延伸 2 氧代羧酸代謝 光合作用 天線蛋白質(zhì) 錯(cuò)配修復(fù) 苯丙氨酸 酪氨酸和色氨酸的生物合成 核糖體 同源重組 氨基糖和核苷酸糖代謝 亞麻酸代謝 萜類骨架生物合成 核苷酸切除修復(fù) DNA 復(fù)制 不飽和脂肪酸的生物合成 戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化 脂肪酸降解 谷胱甘肽代謝 氧化磷酸化 過(guò)氧化物酶體 嘧啶代謝 脂肪酸代謝 蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工 RNA 運(yùn)輸 氨基酸的生物合成 剪接體 56據(jù) 同 時(shí) 在KEGG 富 集 中 只 有 對(duì) 照 中 存 在 且 表 現(xiàn) 為 下 調(diào) 的 代 謝 路 徑 為 硫 甙 生 物 合 成 參 與 該 途 徑 調(diào) 控 的 酪 氨 酸 單 氧 酶 和 酪 氨 酸 單 加 氧 酶 該 蛋 白 家 族 是 高 度 保 守 的 可 溶 性 酸 性 蛋 白 質(zhì) 調(diào) 節(jié) 著 許 多 重 要 細(xì) 胞 生 命活動(dòng) 如新陳代謝 細(xì)胞周期 細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育 細(xì)胞的 存活以及凋亡 只在干旱脅迫下參與的且表現(xiàn)為上調(diào) 的 苯 丙 素 生 物 合 成 和 苯 丙 氨 酸 代 謝 參 與 該 途 徑 調(diào) 控 的苯丙氨酸氨裂解酶和苯丙氨酸解氨酶 干旱應(yīng)答基 因 的 表 達(dá) 物 質(zhì) 主 要 包 括 信 號(hào) 級(jí) 聯(lián) 和 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 節(jié) 蛋 白 如 蛋 白 激 酶 蛋 白 磷 酸 酶 和 轉(zhuǎn) 錄 因 子 保 護(hù) 細(xì) 胞 膜 的 功 能蛋白以及其他蛋白質(zhì) 胚胎發(fā)育晚期的豐富蛋白 抗 氧 化 劑 滲 調(diào) 蛋 白 與 水 通 道 和 離 子 吸 收 相 關(guān) 的 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋白 糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等 3 結(jié)論 植物已經(jīng)進(jìn)化出有效的機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)生物或非生物 的 挑 戰(zhàn) 本 研 究 生 理 水 平 的 結(jié) 果 表 明 干 旱 對(duì) 于 三 七 影 響 較 大 對(duì) 植 物 抗 旱 性 的 多 種 相 關(guān) 酶 進(jìn) 行 分 析 發(fā) 現(xiàn)POD 的 活 性 變 化 大 于SOD 與 對(duì) 照 相 比CAT 變 化 量 最 少 而MDA 顯 著 升 高 且 比 其 他 指 標(biāo) 升 高 得 多 說(shuō) 明 在 三 七 干 旱 脅 迫 過(guò) 程 中MDA 更 為 敏 感 在 觀 測(cè) 三 七受干旱脅迫時(shí)可以重點(diǎn)關(guān)注 對(duì)干旱處理組和對(duì)照 組 的 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 表 明 干 旱 處 理 組 和 對(duì) 照 組 的 差 異 基 因 顯 著 富 集 在 差 異 基 因 中 控 制ABA 合 成 代 謝 的 關(guān) 鍵 酶 9 順 式 環(huán) 氧 類 胡 蘿 卜 素 雙 加 氧 酶 被 顯 著 富 集 說(shuō) 明 干 旱 條 件 下 三 七 可 能 通 過(guò)ABA 相 關(guān) 合 成 酶 的 增 加 調(diào) 控 干 旱 應(yīng) 答 此 外 ABA 能 誘 導(dǎo) 脯 氨 酸 的 積 累 推 測(cè)三七可能通過(guò)增加脯氨酸應(yīng)對(duì)干旱脅迫 4 討論 植 物 抗 旱 性 是 一 種 復(fù) 雜 的 表 型 干 旱 導(dǎo) 致 植 物 多 個(gè) 性 狀 發(fā) 生 變 化 且 每 個(gè) 性 狀 都 由 眾 多 特 異 性 分 子 網(wǎng) 絡(luò) 的 多 效 基 因 調(diào) 節(jié) 由 于 這 種 復(fù) 雜 性 植 物 會(huì) 產(chǎn) 生 多 種 策 略 來(lái) 應(yīng) 對(duì) 干 旱 脅 迫 這 主 要 包 括POD SOD CAT 等 的 酶 保 護(hù) 系 統(tǒng) 和ABA 等 物 質(zhì) 的 非 酶 類 保 護(hù) 系 統(tǒng) 14 當(dāng) 植 物 在 干 旱 脅 迫 下 生 長(zhǎng) 時(shí) 會(huì) 產(chǎn) 生 對(duì) 植 物 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 有 不 利 影 響 的 活 性 氧 ROS 為 應(yīng) 對(duì) 氧 化 損 傷 植 物 細(xì) 胞 中 超 氧 化 物 歧 化 酶 SOD 過(guò) 氧 化 物 酶 POD 和 過(guò) 氧 化 氫 酶 CAT 等 酶 被 激 活 有 研 究 發(fā) 現(xiàn) 隨 著 干 旱 時(shí) 間 的 延 長(zhǎng) 可 溶 性 蛋 白 的 含 量 會(huì) 持 續(xù) 上 升 15 通 常 認(rèn) 為 當(dāng) 受 到 干 旱 脅 迫 的 影 響 時(shí) 葉 綠 素 含 量 會(huì) 下 降 近 幾 年 有 研 究 發(fā) 現(xiàn) 適 當(dāng) 的 干 旱 能 夠 激 發(fā) 植 物 在 逆 境 中 生 存 的 潛 力 在 中 度 干 旱 脅 迫 下 的 植 物 葉 綠 素 含 量會(huì)上升 16 17 在本實(shí)驗(yàn)中 干旱脅迫下葉綠素含量高 于 對(duì) 照 處 理 說(shuō) 明 此 干 旱 程 度 并 未 對(duì) 三 七 葉 綠 素 合 成 產(chǎn) 生 損 傷 此 結(jié) 果 與 左 應(yīng) 梅 等 18 的 研 究 結(jié) 果 一 致 在本實(shí)驗(yàn)的干旱處理下葉綠素含量以及可溶性蛋 白 含 量 與 對(duì) 照 相 比 有 升 高 的 趨 勢(shì) 但 是 升 高 的 量 不 多 前 人 研 究 表 明 當(dāng) 植 物 遭 受 干 旱 時(shí) 可 溶 性 蛋 白 含 量將升高 隨著干旱程度的加重 可溶性蛋白含量升高 的 幅 度 變 大 19 因 此 綜 合 其 他 各 類 指 標(biāo) 可 能 是 此 次 干 旱 程 度 并 未 對(duì) 三 七 的 光 合 以 及 水 分 滲 透 壓 產(chǎn) 生 損 傷 在 本 研 究 中 三 七 受 到 干 旱 脅 迫 后 可 溶 性 蛋 白 POD SOD CAT MDA 均 有 不 同 程 度 的 升 高 其 中 與對(duì)照相比變化最大的是MDA 增加了88 41 MDA 與 植 物 細(xì) 胞 膜 受 傷 害 損 傷 的 程 度 呈 正 相 關(guān) 20 說(shuō) 明 在 干旱處理下細(xì)胞膜系統(tǒng)受較大損傷 三七遭受干旱土 壤 中 含 水 量 降 低 時(shí) 三 七 葉 片 對(duì) 其 敏 感 程 度 排 名 從 高 到 低 依 次 為POD CAT SOD 此 結(jié) 果 與 左 應(yīng) 梅 等 18 在 4 種 人 參 屬 植 物 的 抗 旱 性 比 較 研 究 中 POD 活 性 比 SOD 活 性 在 土 壤 含 水 量 低 時(shí) 敏 感 度 高 相 一 致 且 與 趙 宏 光 等 21 在 調(diào) 整 土 壤 含 水 量 探 討 三 七 葉 片 對(duì) 土 壤 水 分 含 量 的 響 應(yīng) 特 點(diǎn) 研 究 中 對(duì) 土 壤 含 水 量 敏 感 度 排 名 從 高到低依次為POD 活性 SOD 活性一致 對(duì) 干 旱 三 七 轉(zhuǎn) 錄 組 功 能 注 釋 分 析 表 明 9 順 式 環(huán) 氧 類 胡 蘿 卜 素 雙 加 氧 酶 NCED 蛋 白 磷 酸 酶 生 長(zhǎng) 素 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白 等 都 在 代 謝 通 路 上 且 富 集 顯 著 NCED 是 控 制ABA 合 成 代 謝 的 關(guān) 鍵 酶 22 而ABA 是 植 物 缺 水 的 主 要 信 號(hào) 有 研 究 表 明 干 旱 條 件 下 植 物ABA 水 平 明 顯 升 高 另 外ABA 是 觸 發(fā) 干 旱 信 號(hào) 級(jí) 聯(lián) 的 激 素 信 使 干 旱 脅 迫 下 的ABA 能 誘 導(dǎo) 脯 氨 酸 的 積 累 23 24 本 實(shí) 驗(yàn) 中NCED 在 代 謝 通 路 上 顯 著 富 集 說(shuō) 明 三 七 在 受 到 干 旱 脅 迫 時(shí) 積 累ABA 應(yīng) 對(duì) 干 旱 環(huán) 境 水 分 脅 迫 下ABA 增加能誘導(dǎo)脯氨酸的積累 提高細(xì)胞的保水能力 維持 了 細(xì) 胞 正 常 的 代 謝 25 在 本 研 究 中MDA 顯 著 升 高 而 葉 綠 素 含 量 也 升 高 推 測(cè) 三 七 在 本 研 究 中 的 干 旱 脅 迫 下三七積累了脯氨酸 增強(qiáng)了自生的抗旱性 本 實(shí) 驗(yàn) 將 影 響 植 物 抗 旱 性 的 多 種 相 關(guān) 酶 進(jìn) 行 分 析 清 晰 地 展 現(xiàn) 出 三 七 抗 旱 性 規(guī) 律 為 今 后 三 七 遭 受 干 旱 脅 迫 時(shí) 生 理 機(jī) 能 的 變 化 情 況 提 供 科 學(xué) 的 參 考 依 據(jù) 干 旱 脅 迫 對(duì) 文 心 蘭SOD 活 性 和POD 活 性 影 響 程 度 為SOD 活 性 POD 活 性 與 本 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 相 反 可 能 是 植 物 種 類 不 同 其 對(duì) 應(yīng) 的 抗 旱 性 機(jī) 理 存 在 差 異 26 干 旱 處 理 與 對(duì) 照 相 比 CAT 變 化 量 是 所 有 指 標(biāo) 中 最 小 的 丁 菲 等 27 研 究 表 明 CAT 酶 在 構(gòu) 樹 抗 干 旱 脅 迫 上 的 作 用 不 明 顯 MDA 升 高 幅 度 最 大 有 研 究 中 用MDA 含 量 來(lái) 衡 量 三 七 葉 片 膜 脂 過(guò) 氧 化 及 細(xì) 胞 膜 受 傷 害 程 度 本 研 究 中 干 旱 處 理 的MDA 活 性 是 所 有 測(cè) 定 指 標(biāo) 中 升 高 幅 度 最 大 的 說(shuō) 明MDA 在 整 個(gè) 抗 旱 性 機(jī) 理 中 很 重 要 徐 若 等 干 旱 脅 迫 對(duì) 三 七 生 理 指 標(biāo) 的 影 響 及 轉(zhuǎn) 錄 組 分 析 57中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 5 不足與展望 干 旱 脅 迫 對(duì) 于 植 物 研 究 是 一 個(gè) 研 究 重 點(diǎn) 和 難 點(diǎn) 在以往和今后的研究中都是研究熱點(diǎn) 本研究從