園藝學(xué)報(bào) 2021 48 5 960 972 Acta Horticulturae Sinica 960 doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0949 http www ahs ac cn 收稿日期 2020 11 30 修回日期 2021 03 22 基金項(xiàng)目 重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目 cstc2019jscx gksbX0106 重慶市級(jí) 大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃 項(xiàng)目 S202010635181 通信作者 Author for correspondence E mail liyonmgwf swu edu cn 煙管菌 M1 對(duì)番茄灰霉病的防治及促生作用 張靜潔 朱云云 盧亦帆 李 勇 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院 重慶 400715 摘 要 為探究煙管菌 Bjerkandera adusta M1 對(duì)番茄灰霉病的生物防治作用 通過(guò)平板對(duì)峙 帶藥平板培養(yǎng)以及溫室盆栽試驗(yàn)研究了煙管菌 M1 及其發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢 Botrytis cinerea Pers 生 長(zhǎng)的抑制作用 對(duì)番茄灰霉病的防治效果和對(duì)植株的促生作用 對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明 菌株 M1 可顯著 抑制灰葡萄孢菌絲的生長(zhǎng) 光學(xué)顯微鏡與掃描電鏡發(fā)現(xiàn) M1 菌絲可以穿插 纏繞灰葡萄孢菌絲 使灰 葡萄孢菌絲出現(xiàn)膨大 扭曲 萎縮等現(xiàn)象 有明顯的重寄生作用 拮抗試驗(yàn)表明 菌株 M1 發(fā)酵液 Bj adusta fermentation broth 對(duì)灰葡萄孢的抑制率為 47 90 與化學(xué)農(nóng)藥腐霉利 Procymidone 效果相當(dāng) 盆栽試驗(yàn)表明 與只接種灰葡萄孢孢子懸浮液處理相比 施用 M1 發(fā)酵液使番茄灰霉病的病情指數(shù)顯 著降低 防治效果為 55 2 番茄葉片中過(guò)氧化物酶 超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性分別增加了 29 57 136 15 和 534 13 葉片丙二醛含量和電解質(zhì)相對(duì)外滲率分別下降了 19 98 和 51 10 減輕 了病菌對(duì)植株的損害 番茄的株高 莖粗 地上部分生物量和葉片葉綠素含量也分別顯著增加了 63 92 38 04 87 08 和 35 02 M1 發(fā)酵液促生效果明顯 上述結(jié)果表明 煙管菌 M1 及其發(fā)酵液對(duì)灰葡 萄孢生長(zhǎng)有抑制作用 同時(shí)其發(fā)酵液不僅對(duì)番茄灰霉病有較好的防效 還對(duì)番茄植株具一定的促生作用 關(guān)鍵詞 番茄 煙管菌 灰葡萄孢 灰霉病 植株生長(zhǎng) 中圖分類號(hào) S 641 2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 0513 353X 2021 05 0960 13 Effects of Bjerkandera adusta M1 on Gray Mold Prevention and Growth Promotion in Tomato ZHANG Jingjie ZHU Yunyun LU Yifan and LI Yong College of Resources and Environment Southwest University Chongqing 400715 China Abstract The biocontrol efficiency of a local isolate of Bjerkandera adusta M1 against the gray mold and growth promotion in tomato was studied in order to further understand its potential function in agriculture The confrontation culture fermentation broth inhibition and greenhouse pot experiments were conducted to evaluate the inhibitory effect of Bj adusta M1 and its fermentation broth on the Botrytis cinerea Pers and their biocontrol efficiency against the tomato gray mold and plant growth promotion The growth of Bo cinerea was obviously suppressed by Bj adusta M1 through the observations of their confrontation culture Results from the optical and scanning electron microscopic observations showed that the hyphae of Bo cinerea were interspersed and twined by Bj adusta M1 and resulted in hyphal swelling 張靜潔 朱云云 盧亦帆 李 勇 煙管菌 M1 對(duì)番茄灰霉病的防治及促生作用 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 6 960 972 961 atrophy and deformation indicating a strong mycoparasitism Results from the plate antagonism test indicated that the inhibition rate of the Bj adusta M1 fermentation broth against Bo cinerea reached up to 47 90 which was equivalent to that of the chemical procymidone Compared to the Bo cinerea spore suspension application the greenhouse pot experiment showed that the disease index of gray mold was significantly decrease and 55 2 control effect was thus obtained the activity of leaf peroxidase superoxide dismutase and catalase was significantly increased by 29 57 136 15 and 534 13 respectively Meanwhile the malondialdehyde content and the relative electrolyte leakage rate were significantly reduced by 19 98 and 51 10 indicating a reduction of the pathogen damage to plants Plant height stem thickness aboveground biomass and leaf chlorophyll content in tomato plants were increased significantly by 63 92 38 04 87 08 and 35 02 respectively These results demonstrate that Bj adusta M1 and its fermentation broth can inhibit the Bo cinerea growth and effectively control the gray mold while promoting the tomato growth This study concludes that Bj adusta M1 has a great potential to control gray mold in the field Keywords tomato Bjerkandera adusta Botrytis cinerea gray mold plant growth 番茄 Solanum lycopersicum 的大棚種植及連作導(dǎo)致番茄灰霉病越來(lái)越嚴(yán)重 由此引起的損失 可達(dá)年產(chǎn)量的 30 以上 Li et al 2016 Ji et al 2019 同時(shí)還會(huì)增加果實(shí)采摘后的貯存和運(yùn)輸 成本 陳利軍 等 2016 灰葡萄孢 Botrytis cinerea 是番茄灰霉病的致病菌 雷百戰(zhàn) 等 2014 主要危害葉片和果 實(shí) Williamson et al 2007 在適宜環(huán)境下 番茄灰葡萄孢會(huì)分泌一些胞外酶 如果膠酶 纖維 素酶 細(xì)胞壁降解酶和木聚糖酶等 破壞寄主植物細(xì)胞壁 進(jìn)而侵染番茄植株 孔瓊 等 2020 該病原菌屬于寄主非轉(zhuǎn)化型 具有分布廣泛 危害嚴(yán)重且難以控制等特點(diǎn) 施用化學(xué)農(nóng)藥腐霉利仍 然是控制番茄灰霉病的主要措施 Konstantinou et al 2015 但存在病原菌產(chǎn)生抗藥性和破壞生 態(tài)環(huán)境的危險(xiǎn) Sabarwal et al 2018 Toju et al 2018 生物防治因其高效 對(duì)人畜低毒或無(wú)毒 與環(huán)境相容性好等特點(diǎn) 近年來(lái)受到了有機(jī)生產(chǎn)者的 高度關(guān)注 其中利用微生物拮抗來(lái)控制作物灰霉病具有很大的潛力 甘林等 2016 研究了 8 株木 霉菌對(duì)灰葡萄孢的抑制作用 發(fā)現(xiàn)供試木霉菌可以產(chǎn)生兩種對(duì)灰葡萄孢菌絲有抑制作用的代謝物 Gao 等 2018 從健康番茄植株中分離并鑒定了 1 種假單胞菌菌株 QBA5 其可破壞灰葡萄孢的分 生孢子質(zhì)膜 抑制灰葡萄孢的分生孢子萌發(fā) 胚芽管伸長(zhǎng)和菌絲體生長(zhǎng) 荊卓瓊等 2020 發(fā)現(xiàn)解 淀粉芽孢桿菌 HZ 6 3 通過(guò)產(chǎn)生蛋白酶 果膠酶 1 3 葡聚糖酶和淀粉酶 來(lái)抑制病原菌的菌絲 生長(zhǎng) 使其菌絲扭曲 細(xì)胞膨大 形成串狀泡囊結(jié)構(gòu)等 Sawai 等 2017 發(fā)現(xiàn)鏈霉菌產(chǎn)生的揮發(fā) 性化學(xué)物質(zhì)對(duì) 10 株灰霉病菌的生長(zhǎng)有影響 其低濃度 10 3 稀釋 培養(yǎng)濾液對(duì)灰霉病菌 BC1 的孢 子有完全抑制作用 100 因此篩選高效的生防菌防治番茄灰霉病已成為研究熱點(diǎn) 煙管菌 Bjerkandera adusta 是 1 種木腐型真菌 常見(jiàn)于枯木 闊葉樹(shù)倒木及枯枝落葉區(qū) 分 布廣泛 褚衍亮 等 2015 多數(shù)大型真菌的子實(shí)體很少被病原菌和害蟲(chóng)所侵襲 Mier et al 1996 而且機(jī)體在受到破壞性刺激后子實(shí)體能夠代謝產(chǎn)生大量具有活性的殺蟲(chóng)滅菌物質(zhì) Stadler Sterner 1998 可作為生物防治病害的重要資源 目前對(duì)煙管菌的研究多集中在其漆酶合成 工 業(yè)染料廢水生物處理 纖維素及木質(zhì)素降解等方面 Aydin 2016 Moody et al 2018 對(duì)其生 物防治等農(nóng)業(yè)功能的研究較少 張旭輝 2017 在西南大學(xué)紫色土基地土壤中篩選出 1 株煙管菌 Zhang Jingjie Zhu Yunyun Lu Yifan Li Yong Effects of Bjerkandera adusta M1 on gray mold prevention and growth promotion in tomato 962 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 5 960 972 命名為 M1 其菌絲和發(fā)酵液對(duì)油菜核盤(pán)菌有很好的抑制作用 盆栽試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)它能夠降低油菜核 盤(pán)菌的病情指數(shù) 防病效果達(dá)到 71 4 汪文強(qiáng)等 2018 通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)煙管菌 M1 對(duì) 柑橘炭疽病菌的抑菌率可達(dá) 65 7 李素平等 2019 通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)和溫室盆栽試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) 在小麥苗期時(shí)煙管菌 M1 對(duì)禾谷鐮孢菌引發(fā)的病害有較好的防治作用 能誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生抗病性 提高抗病能力 也能促進(jìn)小麥植株生長(zhǎng) 然而 煙管菌對(duì)番茄灰霉病的生物防治作用還鮮有報(bào)道 本研究中以常用于治療蔬菜灰霉病的化學(xué)農(nóng)藥腐霉利 Konstantinou et al 2015 為對(duì)照 通 過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng) 帶藥平板拮抗試驗(yàn)和溫室盆栽試驗(yàn)探究自主篩選分離的煙管菌菌株 M1 對(duì)番茄 灰霉病的防治效果及其生物防治機(jī)制 以期為番茄的安全生產(chǎn)及番茄灰霉病的生物防治提供理論和 實(shí)踐依據(jù) 1 材料與方法 1 1 供試菌種與藥劑 供試菌種 煙管菌 M1 Bjerkandera adusta M1 從西南大學(xué)紫色土基地土壤自主分離 篩選獲得 經(jīng) ITS1 ITS4 引物擴(kuò)增 18S rDNA 序列 測(cè)序比對(duì)鑒定 GenBank 登錄號(hào) KX377676 為煙管菌 Bjerkandera adusta M1 灰葡萄孢 Botrytis cinerea Pers 由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué) 院贈(zèng)予 供試番茄品種為 浦粉鮮桃 購(gòu)自重慶市歇馬鎮(zhèn)農(nóng)資公司 供試藥劑 腐霉利 Procymidone 江西禾益化工股份有限公司生產(chǎn) 購(gòu)自重慶北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn) 農(nóng)資公司 按使用說(shuō)明稀釋 800 倍備用 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 平板對(duì)峙試驗(yàn) 煙管菌 M1 和番茄灰葡萄孢用 PDA 培養(yǎng)基分別在 28 和 25 暗處培養(yǎng) 5 7 d 待菌絲長(zhǎng)滿 平板 活化后備用 利用平板對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)定菌株 M1 活體菌對(duì)灰葡萄孢的體外抑菌效果 在 PDA 平板兩端 分 別接種 1 塊 5 mm 的已活化好的煙管菌和灰葡萄孢菌塊 兩者相距 3 cm 構(gòu)成 2 點(diǎn)對(duì)峙 對(duì)照 只 接種灰葡萄孢 每個(gè)處理重復(fù) 6 次 每天觀察平板內(nèi)生長(zhǎng)情況 拍照記錄 在光學(xué)顯微鏡下觀察拮 抗區(qū)兩者菌絲各自的形態(tài)特征 同時(shí)在兩個(gè)菌塊之間的 PDA 板表面鋪設(shè) 2 cm 2 cm 的錫箔紙 在 28 下培養(yǎng)約 3 d 直到它們相互接觸 長(zhǎng)在錫箔紙上 揭下錫箔紙滴加 2 5 的戊二醛固定和干燥 后 掃描電子顯微鏡觀察煙管菌菌株 M1 對(duì)灰葡萄孢的重寄生作用 1 2 2 拮抗試驗(yàn) 利用平板拮抗試驗(yàn)測(cè)定菌株 M1 發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢的抑制效果 Campanile et al 2007 用直徑 5 mm 的打孔器取活化好的 M1 菌餅 5 塊 接種至裝有 100 mL PDB 培養(yǎng)基的三角瓶中 放置在搖床上 其中裝瓶量 33 3 溫度 28 轉(zhuǎn)速 150 r min 1 發(fā)酵時(shí)間 168 h 制備出 M1 發(fā)酵液 Bj adusta M1 fermentation broth BAFB 4 000 r min 1 離心 10 min 上清液用 0 22 m 無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾 去除上清液中的殘留菌體 過(guò)濾液放在 4 冰箱備用 配制 PDA 培養(yǎng)基 在凝固前加入 M1 無(wú)菌發(fā)酵液 配制成濃度為 0 對(duì)照 和 20 BAFB 的帶藥平板 加入農(nóng)藥腐霉利的操作步驟同上 配制出稀釋 800 倍的帶藥平板 在上述平板中央各 接種 1 塊 5 mm 的灰葡萄孢菌落邊緣菌塊 每個(gè)處理重復(fù) 6 次 在 25 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng) 每天觀 張靜潔 朱云云 盧亦帆 李 勇 煙管菌 M1 對(duì)番茄灰霉病的防治及促生作用 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 6 960 972 963 察并拍照記錄 待對(duì)照長(zhǎng)滿平板 用十字交叉法測(cè)量菌落半徑 計(jì)算菌株 M1 發(fā)酵液和腐霉利對(duì) 灰葡萄孢的抑菌率 抑菌率 對(duì)照菌落半徑 處理菌落半徑 對(duì)照菌落半徑 100 1 2 3 盆栽試驗(yàn) 將灰葡萄孢菌在 PDA 平板上 25 培養(yǎng) 7 d 用無(wú)菌水洗滌孢子 紗布過(guò)濾 濾液用血球計(jì)數(shù)法 計(jì)數(shù)孢子數(shù)量 配制成濃度為 4 5 10 5 CFU mL 1 的灰葡萄孢孢子懸浮液 Bo cinerea spore suspension BCS 用于盆栽植株抗病試驗(yàn) 李素平 等 2019 常規(guī)方法處理番茄種子并育苗 幼苗長(zhǎng)至 3 葉 1 心期時(shí)移栽到盆里 緩苗 20 d 后進(jìn)行如下處理 1 噴施無(wú)菌水 Sterile water 2 噴施灰葡萄孢孢子懸浮液 BCS 3 先噴施菌株 M1 的無(wú)菌發(fā)酵液 48 h 后再噴施灰 葡萄孢孢子懸浮液 BAFB BCS 4 先噴施稀釋 800 倍的腐霉利 48 h 后再噴施灰葡萄孢孢 子懸浮液 Pr BCS 每個(gè)處理 3 盆 5 次重復(fù) 共 60 盆 待灰葡萄孢組完全發(fā)病后統(tǒng)計(jì)記錄病 情級(jí)別 計(jì)算病情指數(shù)和防治效果 病情指數(shù)和防治效果計(jì)算 病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所生測(cè)室發(fā)布的農(nóng)藥田間藥效實(shí) 驗(yàn)準(zhǔn)則 2000 0 級(jí) 植株健康無(wú)病斑 1 級(jí) 病斑面積占總?cè)~面積的百分比 D 5 3 級(jí) 5 D 10 5 級(jí) 10 D 25 7 級(jí) 25 50 病情指數(shù) 各級(jí)病葉數(shù) 各級(jí)代表數(shù)值 葉片總數(shù) 最高代表級(jí)數(shù) 100 防效 對(duì)照好病情指數(shù) 處理病情指數(shù) 對(duì)照病情指數(shù) 100 記錄完病情后第 2 天采樣測(cè)定番茄植株的株高 莖粗 地上部分生物量 將采取的新鮮葉片用 錫箔紙包好 快速帶回實(shí)驗(yàn)室 采用乙醇提取法 王三根 2017 測(cè)定葉綠素含量 參照 Chen 等 2010 的方法對(duì)總酶液提取后測(cè)定防御酶活性 過(guò)氧化物酶 Peroxidase POD 測(cè)定采用愈創(chuàng)木 酚 Guaiacol 法 超氧化物酶 Superoxide dismutase SOD 測(cè)定采用氮藍(lán)四唑 NBT 光還原法 Song et al 2009 過(guò)氧化氫酶 Catalase CAT 的活性測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)吸收法 Gunes et al 2007 丙二醛 Malondialdehyde MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸 TBA 法 王三根 2017 細(xì)胞膜透性測(cè)定采用電解質(zhì)滲透法 袁琳 等 2005 1 2 4 數(shù)據(jù)處理 利用 Excel 2003 整理計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù) IBM SPSS Statistics 19 0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 one way ANOVA 應(yīng)用 Duncan s 極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和 GraphPad Prism 8 軟件繪制作圖 2 結(jié)果與分析 2 1 煙管菌 M1 對(duì)灰葡萄孢的拮抗作用 如圖 1 所示 在對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中 煙管菌的菌落呈雪白色 灰葡萄孢的菌落呈淺灰色 培養(yǎng)前 期 煙管菌 M1 的生長(zhǎng)速度快于灰葡萄孢 接種 4 d 二者菌絲接觸 圖 1 A 與只接種灰葡 萄孢的對(duì)照 圖 1 B 相比灰葡萄孢生長(zhǎng)明顯受到抑制 培養(yǎng) 6 d 后煙管菌繼續(xù)快速生長(zhǎng)至完全覆 蓋灰葡萄孢 并占據(jù)大部營(yíng)養(yǎng)空間 灰葡萄孢菌絲萎縮至消失 說(shuō)明煙管菌 M1 對(duì)灰葡萄孢具有 空間競(jìng)爭(zhēng)作用 在培養(yǎng)基中加入 20 煙管菌 M1 無(wú)菌發(fā)酵液 BAFB 和農(nóng)藥腐霉利 Pr 能夠抑制灰葡萄 孢的菌絲生長(zhǎng) 圖 2 培養(yǎng) 5 d 時(shí) 20 BAFB 和腐霉利對(duì)灰葡萄孢的抑制率分別是 47 9 和 55 5 二者的抑菌率無(wú)顯著差異 抑菌效果相當(dāng) Zhang Jingjie Zhu Yunyun Lu Yifan Li Yong Effects of Bjerkandera adusta M1 on gray mold prevention and growth promotion in tomato 964 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 5 960 972 圖 1 煙管菌菌株 M1 與灰葡萄孢的對(duì)峙培養(yǎng) A 為對(duì)峙圖 平板左側(cè)為煙管菌 M1 右側(cè)為灰葡萄孢菌 B 對(duì)照?qǐng)D只接種灰葡萄孢菌 Fig 1 Confront culture test of Bjerkandera adusta M1 and Botrytis cinerea A Picture of the confrontation the left side of the plate is Bj adusta M1 and the right side is Bo cinerea B Picture of control which is only inoculated with Bo Cinerea 圖 2 培養(yǎng)基中煙管菌 M1 無(wú)菌發(fā)酵液 BAFB 和農(nóng)藥腐霉利 Pr 對(duì)灰葡萄孢的拮抗作用 Fig 2 Antagonistic effect of Bjerkandera adusta M1 fermentation broth BAFB and Procymidone Pr on Botrytis cinerea in culture medium 從圖 3 中可以看出 在光學(xué)顯微鏡下看到 正常的煙管菌 M1 圖 3 A 和灰葡萄孢 圖 3 B 菌絲形態(tài)均勻 表面光滑 菌絲強(qiáng)壯 有生命力 兩者菌絲相比 煙管菌直徑較細(xì) 灰葡萄 孢較粗且有隔膜 在二者菌絲接觸的拮抗區(qū) 灰葡萄孢菌絲膨大變形 圖 3 C 煙管菌菌絲纏繞 于灰葡萄孢上 圖 3 D 其分支插入灰葡萄孢菌絲 圖 3 E 灰葡萄孢菌絲開(kāi)始釋放出細(xì)胞 質(zhì) 菌絲變得空洞 扭曲 萎縮 圖 3 F 而煙管菌菌絲則保持正常形態(tài) 說(shuō)明在二者對(duì)峙作用 時(shí) 煙管菌菌株 M1 可以產(chǎn)生抗性物質(zhì)使灰葡萄孢菌絲畸變 細(xì)胞質(zhì)流失 空洞進(jìn)而瓦解 在掃描電鏡下進(jìn)一步觀察煙管菌 M1 對(duì)灰葡萄孢的重寄生作用 圖 4 發(fā)現(xiàn) 煙管菌 M1 菌絲纏繞于灰葡萄孢菌絲上 圖 4 A 兩者菌絲接觸處 灰葡萄孢菌絲顯示出扭曲 畸變現(xiàn)象 圖 4 B 煙管菌 M1 的分支穿插 纏繞在灰葡萄孢菌絲上 使其凹陷破裂 圖 4 C 張靜潔 朱云云 盧亦帆 李 勇 煙管菌 M1 對(duì)番茄灰霉病的防治及促生作用 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 6 960 972 965 圖 0 光學(xué)顯微鏡下菌株 M1 對(duì)灰葡萄孢菌絲形態(tài)的影響 A 煙管菌 M1 正常菌絲 B 灰葡萄孢正常菌絲 C F 對(duì)峙區(qū)的異常菌絲 Bj 煙管菌菌絲 Bo 灰葡萄孢菌絲 a 膨大變形 b 纏繞 c 插入 d 扭曲 萎縮 Fig 3 Effects of Bjerkandera adusta M1 on hyphal morphology of Botrytis cinerea under optical microscope A Normal hyphae of Bj adusta M1 B Normal hyphae of Bo cinerea C F Abnormal hyphae of confrontation zone Bj Hyphae of Bj adusta M1 Bo Hyphae of Bo cinerea Pers a Swelling deformation b Winding c Penetration d Distortion and atrophy 圖 4 掃描電鏡下煙管菌 M1 對(duì)灰葡萄孢的重寄生作用 Bj 煙管菌菌絲 Bo 灰葡萄孢菌絲 a 纏繞 b 扭曲 萎縮 c 插入 Fig 4 The mycoparasitism of strain M1 against Botrytis cinerea under scanning electron microscope Bj Hyphae of Bj adusta M1 Bo Hyphae of Bo cinerea a Winding b Distortion and atrophy c Penetration 2 2 煙管菌 M1 發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的防治效果 溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明 番茄接種灰葡萄孢孢子懸浮液 BCS 10 d 后 對(duì)照植株病情指數(shù) 高達(dá) 77 3 分別噴施煙管菌發(fā)酵液和腐霉利 48 h 后再接種的處理 BAFB BCS 和 Pr BCS 均 顯著降低了番茄灰霉病的病情指數(shù) 防效分別達(dá)到了 55 2 和 61 4 二者無(wú)顯著差異 防效相當(dāng) 表 1 Zhang Jingjie Zhu Yunyun Lu Yifan Li Yong Effects of Bjerkandera adusta M1 on gray mold prevention and growth promotion in tomato 966 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 5 960 972 表 1 噴施煙管菌 M1 BAFB 和腐霉利 Pr 對(duì)接種灰葡萄孢 BCS 番茄植株的防效 Table 1 Control effect of spraying Bjerkandera adusta M1 fermentation broth BAFB and procymidone Pr on tomato plants inoculated with Botrytis cinerea BCS 處理 Treatment 病情指數(shù) Disease index 防效 Control effect 蒸餾水 Sterile water 0 c BCS 77 3 4 99 a BAFB BCS 35 1 6 00 b 55 2 5 20 a Pr BCS 30 0 6 48 b 61 4 7 15 a 注 表中數(shù)據(jù)均為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤差 n 3 同一列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著 P 0 05 Note The data in the table are mean SE value n 3 different lowercase letters in the same column indicated that there were significant differences among different P 0 05 treatments under Duncan s range test 2 3 煙管菌 M1 發(fā)酵液對(duì)番茄植株相關(guān)防御酶活性的影響 如圖 5 所示 在接種灰葡萄孢病菌的各處理中 番茄葉片 POD SOD 和 CAT 活性均有一定上 圖 5 噴施煙管菌 M1 BAFB 和腐霉利 Pr 對(duì)接種灰葡萄孢 BCS 番茄植株相關(guān)酶 丙二醛和細(xì)胞膜透性的影響 柱狀圖短豎線表示平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 n 3 同一柱狀圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著 P 0 05 Fig 5 Effects of spraying Bjerkandera adusta M1 fermentation broth BAFB and procymidone Pr on defense enzymes malondialdehyde content and cell membrane permeability of tomato plants inoculated with Botrytis cinerea BCS Vertical bars represent mean SE value n 3 different lowercase letters in the same bar represent significant differences P 0 05 among different treatments under Duncan s range test 張靜潔 朱云云 盧亦帆 李 勇 煙管菌 M1 對(duì)番茄灰霉病的防治及促生作用 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 6 960 972 967 升 與 BCS 處理相比 BAFB BCS 處理 POD SOD 和 CAT 活性分別顯著增加了 29 57 136 15 和 534 13 Pr BCS 處理分別增加了 9 38 79 34 和 192 07 MDA 含量與電解質(zhì)相對(duì)外滲率的測(cè)定結(jié)果顯示 接種了灰葡萄孢的 3 個(gè)處理組的 MDA 含量與 電解質(zhì)相對(duì)外滲率均比無(wú)菌水組高 其中 BCS 處理分別顯著增加了 100 75 與 370 44 噴施 BAFB 或 Pr 的處理均降低了染病后植株的 MDA 含量與電解質(zhì)相對(duì)外滲率 其中 BAFB BCS 和 Pr BCS 處理分別顯著減少了 19 98 51 10 和 13 67 與 37 63 2 4 煙管菌 M1 發(fā)酵液對(duì)染病番茄植株的促生作用 BCS 處理組番茄植株的生長(zhǎng)明顯受到抑制 其株高 莖粗 地上部分生物量和葉片葉綠素含量 均低于無(wú)菌水對(duì)照 分別降低了 8 37 11 69 32 33 和 6 88 與 BCS 處理相比 BAFB BCS 處理后番茄的株高 莖粗 地上部分生物量和葉片葉綠素含量均有增加 分別顯著增加了 63 92 38 04 87 08 和 35 02 P 0 05 說(shuō)明噴施 BAFB 能促進(jìn)患病番茄植株生長(zhǎng) Pr BCS 處理 對(duì)植株也有一定的促生作用 但是 BAFB BCS 處理組的促生效果明顯優(yōu)于腐霉利處理 圖 6 噴施煙管菌 M1 BAFB 和腐霉利 Pr 對(duì)接種灰葡萄孢 BCS 番茄植株生長(zhǎng)的影響 柱狀圖短豎線表示平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 n 3 同一柱狀圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著 P 0 05 Fig 6 Effect of spraying Bjerkandera adusta M1 fermentation broth BAFB and procymidone Pr on the growth of tomato plants inoculated with Botrytis cinerea BCS Vertical bars represent mean SE value n 3 different lowercase letters in the same bar represent significant differences P 0 05 among different treatments under Duncan s range test Zhang Jingjie Zhu Yunyun Lu Yifan Li Yong Effects of Bjerkandera adusta M1 on gray mold prevention and growth promotion in tomato 968 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 5 960 972 3 討論 3 1 煙管菌 M1 及其發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢的抑制作用 植物病害的生物防治機(jī)制主要有競(jìng)爭(zhēng)作用 重寄生作用 產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗 性等 劉曉光 等 2007 本研究中 用煙管菌發(fā)酵液制備帶藥平板 能夠抑制灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng) 在對(duì)峙培養(yǎng)中 煙管菌 M1 生長(zhǎng)速度快 能侵入并快速覆蓋灰葡萄孢菌落 阻止病原菌生長(zhǎng) 顯 現(xiàn)出明顯的競(jìng)爭(zhēng)作用 高俊明等 2007 研究番茄內(nèi)源 rayungus ts 6 對(duì)灰葡萄孢的拮抗作用 結(jié)果 顯示 在培養(yǎng) 7 d 后 菌株 ts 6 對(duì)灰葡萄孢的菌絲生長(zhǎng)具有明顯的拮抗作用 可形成直徑為 30 mm 的抑菌帶 顯微鏡下觀察到抑菌帶邊緣菌絲異常擴(kuò)張 明顯分離 菌絲分枝增多 部分菌絲頂端膨 大成囊泡狀 有些囊泡破裂 細(xì)胞質(zhì)外流 本試驗(yàn)也同樣具有以上現(xiàn)象 即煙管菌 M1 對(duì)灰葡萄 孢拮抗作用明顯 拮抗區(qū)灰葡萄孢菌絲膨大 釋放出細(xì)胞質(zhì) 菌絲體變得空洞 微生物菌劑的實(shí)際應(yīng)用常常受到施用環(huán)境和條件的影響 其實(shí)際作用效果不如實(shí)驗(yàn)室效果 但 菌株發(fā)酵液一般而言性質(zhì)穩(wěn)定 不受環(huán)境條件的影響 在實(shí)際田間應(yīng)用備受關(guān)注 Tang et al 2018 木霉菌對(duì)病原菌的拮抗作用 主要是通過(guò)分泌幾丁質(zhì)酶 纖維素酶 葡聚糖酶和蛋白酶等胞外酶溶 解寄主菌絲細(xì)胞壁 從而穿透寄主菌絲 吸取營(yíng)養(yǎng) Elad et al 1984 因此 推測(cè)煙管菌分泌纖 維素酶或者葡聚糖酶和蛋白酶等胞外酶溶解灰葡萄孢菌絲細(xì)胞壁 致使其菌絲扭曲 細(xì)胞質(zhì)外流 菌絲枯萎 從而產(chǎn)生生防效果 在番茄盆栽試驗(yàn)中 接種灰葡萄孢孢子懸浮液后 番茄植株病情指 數(shù)高達(dá) 77 3 噴施煙管菌 M1 發(fā)酵液處理的防效達(dá)到 55 2 與同期的腐霉利處理無(wú)顯著差異 說(shuō)明 M1 發(fā)酵液盆栽生防效果良好 進(jìn)一步肯定了煙管菌發(fā)酵液具有防治番茄灰霉病的作用 但 是關(guān)于煙管菌發(fā)酵液中的活性物質(zhì)種類和組成需要進(jìn)一步鑒定 3 2 煙管菌 M1 發(fā)酵液對(duì)番茄植株相關(guān)防御酶活性的影響及促生作用 植株受到逆境脅迫時(shí) 其正常生理活動(dòng)會(huì)受到影響 體內(nèi)活性氧 ROS 的產(chǎn)生與 SOD POD 和 CAT 等防御酶系統(tǒng)和抗氧化劑清除作用的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被打破 導(dǎo)致產(chǎn)生的 MDA 破壞植物細(xì)胞組 織 影響植株的正常生長(zhǎng)和發(fā)育 Ye et al 2019 Sanoubar et al 2020 植株除了自身的防御體 系外 外界物質(zhì)也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性 誘導(dǎo)植物抗病性包括系統(tǒng)獲得抗病性 System acquired resistance SAR 和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性 Induced systemic resistance ISR 由生防菌引起的植物系統(tǒng) 抗病性屬于誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性 Romera et al 2019 其中寄主植株防御酶活性是表征誘導(dǎo)抗性的重要 指標(biāo) 林陳強(qiáng) 等 2013 SOD 和 POD 是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的主要保護(hù)酶 其協(xié)同作用可 抵抗活性氧對(duì)植物細(xì)胞造成的傷害 也可參與苯酚類 植保素和木質(zhì)素等物質(zhì)的合成 加強(qiáng)組織的 木質(zhì)化 其活性的高低與植物抗逆性密切相關(guān) 張琳 等 2015 陳川燕 等 2017 CAT 也是抗 氧化物酶之一 主要功能是清除植物體內(nèi)的過(guò)氧化氫 H 2 O 2 減少活性氧自由基對(duì)植物組織造成 的傷害 Yang Poovaiah 2002 連清貴等 2016 發(fā)現(xiàn) 壯觀鏈霉菌 SC11 處理番茄植株后 植株防御酶活性均有所提高 誘導(dǎo)其產(chǎn)生了更高的抗病性 并且促進(jìn)了幼苗的生長(zhǎng) 張菁等 2018 研究發(fā)現(xiàn)淡紫擬青霉 Paecilomyces lilacinus 菌株 QLP12 可通過(guò)誘導(dǎo)番茄植株相關(guān)防御酶活性的 提高 有效降低番茄灰霉病的發(fā)病率 由此可知 生防菌對(duì)植物抗病相關(guān)防御酶的誘導(dǎo)是其防治植 物病害發(fā)生的重要機(jī)制之一 MDA 是膜脂過(guò)氧化物分解的最終產(chǎn)物 其含量的高低可反映植物細(xì) 胞膜脂過(guò)氧化作用的強(qiáng)弱 一定程度上反映了植物受逆境傷害的程度 葛秀春 等 2000 植物細(xì) 胞受到侵害時(shí) 會(huì)通過(guò)增加細(xì)胞膜透性 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)減少外來(lái)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷 因此細(xì)胞膜 張靜潔 朱云云 盧亦帆 李 勇 煙管菌 M1 對(duì)番茄灰霉病的防治及促生作用 園藝學(xué)報(bào) 2021 48 6 960 972 969 透性也是植物抗逆性強(qiáng)弱的標(biāo)志之一 王蕾 等 2016 本研究中發(fā)現(xiàn) 番茄植株受到灰葡萄孢脅 迫時(shí) 與健康植株相比 葉片中 POD SOD 和 CAT 活性略有升高 說(shuō)明病原菌可以誘導(dǎo)植株相關(guān) 防御活性提高 灰葡萄孢脅迫時(shí) MDA 含量和細(xì)胞膜透性迅速增大 說(shuō)明植株細(xì)胞膜和結(jié)構(gòu)受到 病菌的破壞 對(duì)番茄植株添加腐霉利后再接種灰葡萄孢處理較只接種灰葡萄孢處理的 SOD POD CAT 活性有一定程度增加 與前人研究結(jié)果 張菁 等 2018 相符 李泳等 2020 發(fā)現(xiàn) 健康 番茄植株噴施腐霉利后這 3 種酶酶活性也相對(duì)增加 本研究結(jié)果與其相似 在添加煙管菌 M1 發(fā)酵 液處理組中 POD SOD 和 CAT 活性有更大程度的增加 說(shuō)明 M1 發(fā)酵液可誘導(dǎo)植物進(jìn)一步提高 相關(guān)防御酶的活性 提高對(duì)灰葡萄孢的抗性 同時(shí) M1 發(fā)酵液處理后 植物葉片 MDA 含量和細(xì)胞 膜透性增幅減小 說(shuō)明煙管菌 M1 發(fā)酵液處理可增加植株誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性 加強(qiáng)防御系統(tǒng) 防御酶活 性提高 增強(qiáng)了清除葉片組織內(nèi)產(chǎn)生的活性氧能力 葉片膜質(zhì)過(guò)氧化程度下降 MDA 含量降低 細(xì)胞膜通透性降低 減少了病菌對(duì)葉片組織細(xì)胞的傷害程度 本研究中還發(fā)現(xiàn) 先添加煙管菌 M1 菌株無(wú)菌發(fā)酵液或農(nóng)藥腐霉利再接種灰葡萄孢孢子懸浮 液 番茄植株的株高 莖粗 地上部分生物量和葉片葉綠素含量相比于只接種灰霉病菌處理都有增 加 甚至超過(guò)健康植株 這與張菁等 2018 對(duì)感染灰霉病番茄噴施腐霉后發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似 李素 平等 2019 發(fā)現(xiàn) 煙管菌 M1 無(wú)菌發(fā)酵液促進(jìn)了小麥對(duì) N P K 等養(yǎng)分吸收 葉片葉綠素含 量與硝化還原酶活性增加 本研究也發(fā)現(xiàn)先添加煙管菌 M1 發(fā)酵液再接種灰霉病菌孢子處理的葉 綠素含量較只接種灰霉病菌處理增加了 35 02 說(shuō)明煙管菌 M1 無(wú)菌發(fā)酵液可通過(guò)提高植物養(yǎng) 分吸收 光合作用和物質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)植株生長(zhǎng) 是否還存在其他的促生機(jī)制還有待深入研究