鐵皮石斛DoSMT2基因的功能分析.pdf
西北植物學(xué)報 2 0 2 1 4 1 4 0 5 5 8 0 5 6 4 Acta Bot Boreal Occident Sin doi 1 0 7 6 0 6 j i s s n 1 0 0 0 4 0 2 5 2 0 2 1 0 4 0 5 5 8 h t t p x b z w x b a l l j o u r n a l n e t 收稿日期 2 0 2 1 0 1 1 4 修改稿收到日期 2 0 2 1 0 3 1 9 基金項目 福建省自然科學(xué)基金 2 0 1 8 J 0 1 1 1 9 作者簡介 林江波 1 9 7 6 男 碩士 副研究員 從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究 E m a i l 3 4 5 9 5 3 2 5 7 q q c o m 通信作者 戴藝民 博士 研究員 從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究 E m a i l d y m t t c n 1 6 3 c o m 鐵皮石斛DoSMT2基因的功能分析 林江波 王偉英 鄒 暉 戴藝民 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所 福建漳州 3 6 3 0 0 5 摘 要 為了揭示鐵皮石斛 Dendrobium officinale 甾醇C 2 4甲基轉(zhuǎn)移酶2基因 DoSMT2 在甾醇代謝過程的功 能 該研究通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來源于鐵皮石斛的DoSMT2基因轉(zhuǎn)化煙草 Nicotiana tabacum 并采用q R T P C R技術(shù)檢測DoSMT2基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的表達 采用氣相色譜質(zhì)譜法分析菜油甾醇和谷甾醇的含量 結(jié)果顯示 1 成功獲得DoSMT2基因的開放閱讀框 1 1 1 9 b p 并成功構(gòu)建正義植物表達載體質(zhì)粒p C X S N DoSMT2 經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草并鑒定 獲得4株陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株 2 S o u t h e r n b l o t結(jié) 果表明 4株轉(zhuǎn)基因煙草植株都有1條雜交信號帶 而非轉(zhuǎn)基因煙草植株沒有 說明外源DoSMT2基因都以單拷貝 整合到4株轉(zhuǎn)基因煙草基因組中 3 q R T P C R檢測顯示 非轉(zhuǎn)基因煙草未檢測到外源DoSMT2基因的表達 4 株轉(zhuǎn)基因煙草都能檢測到DoSMT2基因的表達 且表達水平差異極顯著 各株系表達量高低依次為P 3 P 1 P 2 P 4 4 氣相色譜質(zhì)譜分析顯示 轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草葉片的菜油甾醇含量均極顯著低于非轉(zhuǎn)基因煙草葉片 而谷甾醇含量均極顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草葉片 研究表明 D o S M T 2具有催化2 4 亞甲基膽甾烯醇轉(zhuǎn)化形成2 4 亞 乙基膽甾烯醇活性 關(guān)鍵詞 鐵皮石斛 甾醇C 2 4甲基轉(zhuǎn)移酶 煙草 遺傳轉(zhuǎn)化 功能 中圖分類號 Q 7 8 5 Q 7 8 6 Q 7 8 9文獻標志碼 A Functional Analyses of DoSMT2 Gene Isolated from Dendrobium officinale L I N J i a n g b o W A N G W e i y i n g Z O U H u i D A I Y i m i n F u j i a n A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s S u b t r o p i c a l A g r i c u l t u r e R e s e a r c h I n s t i t u t e Z h a n g z h o u F u j i a n 3 6 3 0 0 5 C h i n a Abstract I n o r d e r t o r e v e a l t h e f u n c t i o n o f t h e s t e r o l C 2 4 m e t h y l t r a n s f e r a s e 2 g e n e DoSMT2 i n t h e s t e r o l m e t a b o l i s m p r o c e s s o f Dendrobium officinale w e f i r s t l y t r a n s f o r m e d t h e DoSMT2 g e n e i n t o t o b a c c o Nicotiana tabacum b y Agrobacterium tumefaciens m e d i a t e d m e t h o d q R T P C R w a s t h e n a p p l i e d t o d e t e c t e d t h e DoSMT2 g e n e e x p r e s s i o n i n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s a n d t h e c o n t e n t s o f b r a s s i n o s t e r o l a n d s i t o s t e r o l w e r e a n a l y z e d b y G C M S T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 1 a 1 1 1 9 b p o p e n r e a d i n g f r a m e O R F o f DoSMT2 g e n e w a s s u c c e s s f u l l y o b t a i n e d t h e r e a f t e r t h e s e n s e p l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p C X S N DoSMT2 w a s s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d t o o F o u r p o s i t i v e t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s w e r e o b t a i n e d a n d i d e n t i f i e d b y t o b a c c o l e a f d i s c t r a n s f o r m a t i o n t h r o u g h A tumefaciens m e d i a t e d m e t h o d 2 S o u t h e r n b l o t r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w a s a h y b r i d i z a t i o n s i g n a l b a n d i n a l l t h e f o u r t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s w h i l e i t w a s n o t f o u n d i n n o n t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s w h i c h i n d i c a t e d t h a t t h e f o r e i g n g e n e DoSMT2 w a s i n t e g r a t e d i n t o t h e g e n o m e o f t h e t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s i n a s i n g l e c o p y m o d e 3 T h e DoSMT2 g e n e e x p r e s s i o n w a s n o t d e t e c t e d i n n o n t r a n s g e n i c t o b a c c o w h i l e t h e e x p r e s s i o n o f DoSMT2 g e n e c o u l d b e d e t e c t e d i n a l l f o u r t r a n s g e n i c t o b a c c o p l a n t s b y q R T P C R a n d t h e d i f f e r e n c e o f e x p r e s s i o n l e v e l w a s s i g n i f i c a n t T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f e a c h l i n e w a s P 3 P 1 P 2 P 4 i n t u r n 4 T h e G C M S a n a l y s i s r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e c o n t e n t o f c a m p e s t e r o l i n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t i n n o n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s w h i l e t h e c o n t e n t o f s i t o s t e r o l i n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n n o n t r a n s g e n i c t o b a c c o l e a v e s T h i s s t u d y i n d i c a t e d t h a t t h e D o S M T 2 p r o t e i n h a d t h e c a t a l y t i c a c t i v i t y i n t h e t r a n s f o r m a t i o n f r o m 2 4 m e t h y l e n e l o p h e n o l t o 2 4 e t h y l i d e n e l o p h e n o l Key words Dendrobium officinale s t e r o l C 2 4 m e t h y l t r a n s f e r a s e t o b a c c o g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n f u n c t i o n 植物甾醇是一類甾體類植物天然活性物質(zhì) 具 有延緩衰老 1 抗氧化 2 和抗腫瘤 3 等功效 植物 甾醇根據(jù)側(cè)鏈C 2 4位上烷基的有無分為無烷基甾 醇 甲基甾醇和乙基甾醇 菜油甾醇和菜籽甾醇屬于 甲基甾醇 豆甾醇和 谷甾醇屬于乙基甾醇 4 5 周 海玥等 6 研究發(fā)現(xiàn) 豆甾醇和 谷甾醇具有改善非 酒精性脂肪肝肝細胞脂肪變性程度及減輕氧化應(yīng)激 反應(yīng)的作用 張碩等 7 研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草豆甾醇 具有抑制肝癌細胞增殖 促進癌細胞凋亡的作用 周 玲玉等 8 研究發(fā)現(xiàn) 谷甾醇可以誘導(dǎo)人肺癌A 5 4 9 細胞G 2 M期細胞周期阻滯 引起癌細胞凋亡 甾 醇C 2 4甲基轉(zhuǎn)移酶2 S M T 2 催化2 4 亞甲基膽甾 烯醇合成2 4 亞乙基膽甾烯醇 9 1 0 是乙基甾醇合成 關(guān)鍵酶 開展SMT2基因功能研究對研究植物甾醇 的代謝和調(diào)控具有重要意義 目前 已經(jīng)從多種植 物中克隆到SMT2基因 1 1 1 3 但是開展SMT2基 因功能研究的還少有報道 鐵皮石斛 Dendrobium officinale 是蘭科 O r c h i d a c e a e 石斛屬 Dendrobium S w 的名貴中藥 材 位列 中華九大仙草 之首 其功效成分主要有多 糖 石斛堿 黃酮和甾醇類等 1 4 1 8 具有提高免疫力 和抗腫瘤等生理活性 1 9 2 2 本課題組基于對鐵皮 石斛莖和葉的轉(zhuǎn)錄組測序 分析了鐵皮石斛植物甾 醇的代謝途徑 分3個階段 5 0個u n i g e n e s 3 0種 酶 參與 鐵皮石斛甾醇C 2 4甲基轉(zhuǎn)移酶2基因 DoSMT2 在葉的表達量高于莖 生長期高于成熟 期 2 3 克隆了鐵皮石斛DoSMT2基因的全長c D N A序列 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明D o S M T 2蛋白 屬于A d o M e t M T a s e s超級家族 含有4個S 腺苷 蛋氨酸結(jié)合位點 1個甲基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域和1 個甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶C末端保守結(jié)構(gòu)域 與深圳擬蘭 Apostasia shenzhenica 的S M T 2親緣關(guān)系最 近 2 4 本研究構(gòu)建了DoSMT2基因正義植物表達 載體 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化煙草 分析 DoSMT2基因功能 以期為進一步了解鐵皮石斛植 物甾醇代謝機理奠定基礎(chǔ) 1 材料和方法 1 1 試驗材料 大腸桿菌 Esherichia coli D H 5 菌株 根癌 農(nóng)桿菌 Agrobacterium tumefaciens E H A 1 0 5菌 株 P c x S N植物表達載體和煙草 Nicotiana taba cum N C 8 9無菌試管苗由本實驗室保存 Xcm 購自N E B公司 2 A c c u r a t e T a q M a s t e r M i x d y e p l u s S t e a d y P u r e植物R N A提取試 劑盒和S Y B R G r e e n Pro Taq H S 預(yù)混型q P C R試 劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司 D N A L i g a t i o n K i t V e r 2 1和P r i m e S c r i p t T M 逆轉(zhuǎn)錄酶購 自寶生物工程 大連 有限公司 頭孢噻肟鈉 c e f o t a x i m e s o d i u m 特泯菌 t i m e n t i n 乙酰丁香酮 a c e t o s y r i n g o n e 潮霉素 B 溶液 h y g r o m y c i n B s o l u t i o n D N A膠回收試劑盒 U N I Q 1 0柱式質(zhì)粒 小量抽提試劑盒購自生工生物工程 上海 股份有限 公司 菜油甾醇 L o t B 0 4 0 8 A S 和谷甾醇 L o t N 0 6 1 5 A S 標準品購自上海源葉生物科技有限公司 1 2 方 法 1 2 1 DoSMT2基因開放閱讀框的克隆 以重組 的克隆載體質(zhì)粒p M D 1 9 T DoSMT2 2 4 為模板 利 用引物SMT F和SMT R 表1 擴增DoSMT2基 因的開放閱讀框 P C R擴增體系5 0 L 質(zhì)粒 p M D 1 9 T DoSMT2 1 L 引物 1 0 m m o l L 1 各 1 L 2 A c c u r a t e T a q M a s t e r M i x 2 5 L d d H 2 O 2 2 L P C R反應(yīng)程序為 9 4 預(yù)變性5 m i n 9 4 變性3 0 s 5 8 退火3 0 s 7 2 延伸2 m i n 3 0個循 環(huán) 最后7 2 延伸1 0 m i n P C R產(chǎn)物經(jīng)1 2 瓊脂 糖凝膠電泳驗證后 膠回收目的片段 1 2 2 植物表達載體的構(gòu)建 植物表達載體p C X S N經(jīng)Xcm 酶切 酶切產(chǎn)物經(jīng)1 2 瓊脂糖凝膠 電泳驗證后 膠回收載體片段 回收產(chǎn)物與 DoSMT2基因的膠回收產(chǎn)物在1 6 連接2 h 連接 9554期 林江波 等 鐵皮石斛DoSMT2基因的功能分析 體系1 0 L p C X S N酶切回收產(chǎn)物2 L DoSMT2基 因膠回收產(chǎn)物3 L S o l u t i o n I 5 L 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 大腸肝菌D H 5 感受態(tài)細胞后 在1 0 5 r m i n 1 3 7 條件下振蕩培養(yǎng)1 h后 菌液涂布于含卡那霉素 1 0 0 m g L 1的L B固體培養(yǎng)基上 3 7 倒置培養(yǎng) 過夜 挑取單克隆在含卡那霉素1 0 0 m g L 1的 液體L B培養(yǎng)基中 3 7 條件下2 0 0 r m i n 1振蕩 培養(yǎng)過夜 提取經(jīng)P C R鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒 委 托生工生物工程 上海 有限公司測序 通過序列比 對獲得重組的正義植物表達載體質(zhì)粒p C X S N DoSMT2 圖1 1 2 3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)重組質(zhì)粒pCXSN DoSMT2遺 傳轉(zhuǎn)化煙草 采用 凍融法 將重組正義植物表達載 體質(zhì)粒p C X S N DoSMT2導(dǎo)入農(nóng)桿菌E H A 1 0 5中 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法 2 5 將p C X S N DoSMT2基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草 獲得抗潮霉素的抗性 轉(zhuǎn)化植株 煙草轉(zhuǎn)化植株種植于溫室大棚 表1 PCR引物 T a b l e 1 P C R p r i m e r s 引物P r i m e r序列S e q u e n c e 5 3 SMT F C C G G A A T T C A T G G A T A C G G C T G C G C T G C T SMT R C C G C T C G A G C T C G C C T C C A T A C T A T G A G C Hpt1 G A T G T T G G C G A C C T C G T A T T Hpt2 T C G T T A T G T T T A T C G G C A C T T T SMTB o l t F T T T C T T A T G A A T G G G T T A C G A C T G SMTB o l t R A A T T G G C T T G C G G C A G A G T SMT2 F T C A A C G A G T A C C A G G T C A G C SMT2 R T A G C C T C G A T T G A G T A A G C C NtACT F A T C C T C G C A T C C C T T A G C A C NtACT R G C C C C A C C T T C A A A G A C T C C 圖1 植物表達載體p C X S N DoSMT2的構(gòu)建 F i g 1 C o n s t r u c t i o n o f p l a n t e x p r e s s i o n v e c t o r p C X S N DoSMT2 1 2 4 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測 以C T A B法提取 的煙草抗性轉(zhuǎn)化植株葉片基因組D N A為模板 用 引物Hpt1和Hpt2進行P C R擴增潮霉素基因片 段 篩選抗性轉(zhuǎn)化植株 產(chǎn)物長度為5 1 7 b p 用引 物SMTB o l t F和SMTB o l t R進行 P C R法制備地 高辛標記探針 經(jīng)P C R檢測為陽性的煙草植株基因 組D N A用Hind 酶切后用于S o u t h e r n b l o t S o u t h e r n b l o t委托生工生物工程 上海 股份有限 公司完成 用S t e a d y P u r e植物R N A提取試劑盒提取轉(zhuǎn) DoSMT2基因煙草葉片總R N A 用P r i m e S c r i p t T M 逆轉(zhuǎn)錄酶合成c D N A第1鏈 將合成的c D N A第1 鏈濃度定量為2 0 0 n g L 1 以煙草Actin基因作 為內(nèi)參基因 根據(jù)S Y B R G r e e n Pro Taq H S 預(yù)混 型q P C R試劑盒的說明書進行實時熒光定量P C R 擴增 R o c h e L i g h t C y c l e r 9 6 檢測外源DoSMT2 基因在不同轉(zhuǎn)基因煙草中的表達情況 DoSMT2 基因引物為SMT2 F和SMT2 R 煙草Actin基因 引物為NtACT F和NtACT R 1 2 5 轉(zhuǎn)基因煙草植物甾醇含量測定 轉(zhuǎn)基因煙 草葉片菜油甾醇和谷甾醇的含量委托青島科創(chuàng)質(zhì)量 檢測有限公司測定 參考李濤等 2 6 的方法 1 樣品前處理 取0 5 g轉(zhuǎn)基因煙草葉片粉 末 于取樣瓶中 以非轉(zhuǎn)基因煙草葉片為對照 加入5 m L二氯甲烷 超聲波萃取2 0 m i n 6 0 0 0 r m i n 1離 心5 m i n 分離取出二氯甲烷 再加入5 m L二氯甲 烷超聲波萃取1 0 m i n 離心分離取出二氯甲烷 合 并2次萃取液 用二氯甲烷定容至1 0 m L 過0 4 5 m濾膜后 進樣分析 2 色譜條件 T h e r m o T G 5 M S色譜柱 3 0 m 0 2 5 m m 0 2 5 m 進樣量2 L 升溫程序 8 0 保持2 m i n 以2 0 m i n 1的速率升溫至3 0 0 保持1 5 m i n 進樣口溫度為3 0 0 載氣為H e 載氣流速為0 8 m L m i n 1 分流比為4 0 1 3 質(zhì)譜條件 離子源溫度2 0 0 傳輸線溫度 2 5 0 溶劑延遲時間3 0 0 m i n 掃描范圍3 0 4 5 0 m z 離子源為E I源7 0 e V 1 3 數(shù)據(jù)處理 方差分析采用D P S軟件 2 7 差異顯著性用最 小顯著差數(shù)法 L S D 進行平均數(shù)的多重比較 2 結(jié)果與分析 2 1 DoSMT2基因開放閱讀框克隆 以重組克隆載體質(zhì)粒p M D 1 9 T DoSMT2為 065西 北 植 物 學(xué) 報 4 1卷 模板 利用引物SMT F和SMT R擴增DoSMT2 基因的開放閱讀框 擴增產(chǎn)物在1 1 1 9 b p處有1條 特異性條帶 圖2 膠回收目的條帶 獲得DoSMT2 基因的開放閱讀框 2 2 植物表達載體的構(gòu)建與鑒定 膠回收Xcm 酶切后植物表達載體p C X S N片段 與DoSMT2基因膠回收產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化D H 5 感受 態(tài)細胞 挑取單克隆于含有1 0 0 m g L 1卡那霉素的 液體L B培養(yǎng)基擴繁 經(jīng)菌液P C R鑒定 圖3 后 提 取陽性克隆菌株的質(zhì)粒并進行測序 通過序列比對分 析 獲得正義植物表達載體質(zhì)粒p C X S N DoSMT2 2 3 轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR檢測 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法將重組正義 植物表達載體p C X S N DoSMT2遺傳轉(zhuǎn)化煙草 通 過潮霉素抗性篩選 共獲得6株抗潮霉素煙草植株 提取6株抗潮霉素煙草植株基因組D N A 以Hpt1 和Hpt2作為引物 P C R擴增潮霉素基因片段 其 中4株能擴增到1條5 1 7 b p特異條帶 圖4 分別 M D L 2 0 0 0 1 2 DoSMT2 圖2 DoSMT2基因開放閱讀框P C R產(chǎn)物電泳 F i g 2 P C R p r o d u c t e l e c t r o p h o r e s i s o f DoSMT2 g e n e O R F M D L 2 0 0 0 1 3 4 DoSMT2 2 5 陰性克隆 圖3 重組質(zhì)粒p C X S N DoSMT2的P C R檢測 M D L 2 0 0 0 1 3 4 DoSMT2 2 5 N e g a t i v e c l o n e F i g 3 P C R d e t e c t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d p C X S N DoSMT2 用代號P 1 P 2 P 3和P 4表示 以4株能擴增到潮 霉素基因片段的煙草植株基因組D N A為模板 以 SMT F和SMT R為引物 擴增DoSMT2基因 4 株轉(zhuǎn)基因煙草植株在1 1 1 9 b p處能擴增出1條特 異條帶 圖5 而非轉(zhuǎn)基因植株沒有該條帶 說明外 源DoSMT2基因已經(jīng)整合到煙草基因組中 2 4 轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草基因組DNA的South ern blot檢測 經(jīng)過潮霉素基因和DoSMT2基因的P C R檢測 為陽性的4株轉(zhuǎn)基因煙草植株和非轉(zhuǎn)基因煙草植株 的基因組D N A用Hind 酶切 以D I G標記的 DoSMT2基因為探針進行S o u t h e r n雜交 以 p M D 1 9 T DoSMT2為陽性對照 結(jié)果表明 4株 轉(zhuǎn)基因煙草植株都有1條雜交信號帶 非轉(zhuǎn)基因煙 草植株沒有雜交信號帶 圖6 說明外源DoSMT2 基因都以單拷貝整合到4株轉(zhuǎn)基因煙草基因組中 M D L 2 0 0 0 1 6 潮霉素抗性植株 圖4 潮霉素基因片段的P C R檢測 M D L 2 0 0 0 1 6 H y g r o m y c i n r e s i s t a n t p l a n t l e t F i g 4 P C R d e t e c t i o n o f h y g r o m y c i n g e n e f r a g m e n t M D L 2 0 0 0 P 1 P 4 潮霉素抗性植株 C K 非轉(zhuǎn)基因植株 C K p M D 1 9 T DoSMT2 圖5 DoSMT2基因的P C R檢測 M D L 2 0 0 0 P 1 P 4 H y g r o m y c i n r e s i s t a n t t o b a c c o C K N o n t r a n s g e n i c t o b a c c o C K p M D 1 9 T DoSMT2 F i g 5 P C R d e t e c t i o n o f DoSMT2 g e n e 1654期 林江波 等 鐵皮石斛DoSMT2基因的功能分析 M D N A 分子量標記 P 1 P 4 轉(zhuǎn)基因煙草植株 C K 非轉(zhuǎn)基因煙草植株 C K p M D 1 9 T DoSMT2 圖6 轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草植株的S o u t h e r n b l o t雜交結(jié)果 M D N A m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r P 1 P 4 T r a n s g e n i c t o b a c c o C K N o n t r a n s g e n i c t o b a c c o C K p M D 1 9 T DoSMT2 F i g 6 S o u t h e r n b l o t o f t r a n s g e n i c t o b a c c o w i t h DoSMT2 g e n e C K 非轉(zhuǎn)基因煙草 P 1 P 4 轉(zhuǎn)基因煙草 柱上不同大寫字母 表示差異極顯著 P P 1 P 4 P 2 3 討 論 植物甾醇是生物膜的組成成分 具有調(diào)節(jié)膜流 動性和滲透性的作用 甾醇C 2 4甲基轉(zhuǎn)移酶 s t e r o l C 2 4 m e t h y l t r a n s f e r a s e S M T 分為S M T 1和 S M T 2兩個家族 S M T 1催化C 2 4位的第一次甲 基化 完成甲基從S 腺苷甲硫氨酸到環(huán)阿屯醇的轉(zhuǎn) 移 形成C 2 4甲烯基環(huán)阿屯醇 S M T 2催化C 2 4位 的第二次甲基化 形成2 4 亞乙基膽甾烯醇 2 8 S M T 2位于植物甾醇合成途徑中甲基甾醇和乙 基甾醇的一個分支點 已有研究結(jié)果表明 以 C a M V 3 5 S或T E T 1作為組成型啟動子 利用根癌 農(nóng)桿菌把擬南芥SMT2基因轉(zhuǎn)化煙草 對轉(zhuǎn)基因煙 草葉片甾醇測定發(fā)現(xiàn) 菜油甾醇的含量下降 同時谷 甾醇的含量增加 其他甲基甾醇 乙基甾醇和總甾醇 含量與對照差異不大 說明SMT2基因主要調(diào)節(jié)植 物細胞中甲基甾醇菜油甾醇和乙基甾醇谷甾醇的含 量和比例 不改變植物細胞中總甾醇的含量 2 9 3 1 因此 通過檢測轉(zhuǎn)基因植株中菜油甾醇和谷甾醇含 量的變化 可以驗證SMT2基因的功能 本研究以 C a M V 3 5 S作為組成型啟動子 通過根癌農(nóng)桿菌介 導(dǎo) 把DoSMT2基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草 經(jīng)過基因組水 平檢測 獲得了4株在組成型啟動子C a M V 3 5 S控 制下的轉(zhuǎn)DoSMT2基因煙草植株 q R T P C R技術(shù) 檢測表明 DoSMT2基因在4株轉(zhuǎn)基因煙草葉片中 都有表達 且表達量存在極顯著的差異 通過分析 轉(zhuǎn)基因煙草葉片菜油甾醇和谷甾醇的含量發(fā)現(xiàn) 265西 北 植 物 學(xué) 報 4 1卷 DoSMT2基因在煙草葉片中的表達量與菜油甾醇 含量呈負相關(guān) 與谷甾醇含量呈正相關(guān) 轉(zhuǎn)基因煙 草植株葉片菜油甾醇含量是非轉(zhuǎn)基因煙草的0 6 2 0 7 9倍 極顯著降低 谷甾醇含量是非轉(zhuǎn)基因煙 草的1 5 4 2 2 2倍 極顯著升高 綜上所述 D o S M T 2具有催化2 4 亞甲基膽甾 烯醇合成2 4 亞乙基膽甾烯醇的酶活性 本研究結(jié) 果為后續(xù)調(diào)控鐵皮石斛植物甾醇生物合成及開發(fā)利 用鐵皮石斛葉片植物甾醇打下了基礎(chǔ) 參考文獻 1 R U D K O W S K A I P l a n t s t e r o l s a n d s t a n o l s f o r h e a l t h y a g e i n g J Maturitas 2 0 1 0 66 2 1 5 8 1 6 2 2 吳時敏 吳謀成 馬 莉 植物甾醇在菜籽高級烹調(diào)油中的抗 氧化作用 高溫下抗氧化作用的研究 J 中國油脂 2 0 0 3 28 5 3 2 3 3 W U S M W U M C M A L A n t i o x i d a n t e f f e c t o f p h y t o s t e r o l s i n h i g h g r a d e r a p e s e e d c o o k i n g o i l a n t i o x i d a n t e f f e c t a t h i g h t e m p e r a t u r e J China Oils and Fats 2 0 0 3 28 5 3 2 3 3 3 曹 玫 歐陽露 植物甾醇的抗腫瘤作用及其機制研究進展 J 實用藥物與臨床 2 0 1 5 18 9 1 1 0 4 1 1 0 7 C A O M O U Y A N G L S t u d y o n d e v e l o p m e n t o f a n t i t u m o r e f f e c t o f p h y t o s t e r o l s J Practical Pharmacy and Clinical Remedies 2 0 1 5 18 9 1 1 0 4 1 1 0 7 4 耿敬章 梁加敏 許璐璐 等 植物甾醇的生理功能及其開發(fā) 前景 J 飲料工業(yè) 2 0 1 5 18 5 7 0 7 3 G E N G J Z L I A N G J M X U L L et al T h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f p h y t o s t e r o l a n d i t s d e v e l o p m e n t p r o s p e c t s J Beverage Industry 2 0 1 5 18 5 7 0 7 3 5 林江波 王偉英 鄒 暉 等 植物甾醇生物合成與關(guān)鍵酶基 因研究進展 J 農(nóng)業(yè)科學(xué) 2 0 1 8 3 5 7 L I N J B W A N G W Y Z O U H et al R e s e a r c h p r o g r e s s i n b i o s y n t h e s i s a n d k e y s y n t h a s e g e n e o f p h y t o s t e r o l J Agri cultural Science 2 0 1 8 3 5 7 6 周海玥 湯 威 姜 婧 等 谷甾醇與豆甾醇對非酒精性 脂肪肝作用的體外研究 J 營養(yǎng)學(xué)報 2 0 1 6 38 5 4 5 6 4 6 1 Z H O U H Y T A N G W J I A N G J et al E f f e c t s o f s i t o s t e r o l a n d s t i g m a s t e r o l o n n o n a l c o h o l i c f a t t y l i v e r d i s e a s e in vitro J Acta Nutrimenta Sinica 2 0 1 6 38 5 4 5 6 4 6 1 7 張 碩 岳 旺 王 蕾 等 白花蛇舌草豆甾醇對肝癌細胞 的體內(nèi)外抑制作用及對其增殖周期 凋亡的影響 J 現(xiàn)代生 物醫(yī)學(xué)進展 2 0 0 8 8 1 1 2 0 1 6 2 0 1 7 Z H A N G S Y U E W W A N G L et al I n h i b i t i v e e f f e c t o f s t i g m a s t e r o l f r o m Hedyotis diffusa W i l l d o n h e p a t o m a c e l l s in vitro vivo a n d i t s i n f l u e n c e o n t r a n s p l a n t e d H 2 2 t u m o r c e l l s m u l t i p l i c a t i o n c y c l e a p o p t o s i s J Progress in Modern Biomedicine 2 0 0 8 8 1 1 2 0 1 6 2 0 1 7 8 周玲玉 徐 彩 王樂琴 等 谷甾醇對人肺癌A 5 4 9細胞 增殖及凋亡的影響 J 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志 2 0 1 6 37 7 8 6 5 8 6 7 Z H O U L Y X U C W A N G L Q et al E f f e c t o f s i t o s t e r o l o n p r o l i f e r a t i o n a n d a p o p t o s i s o f l u n g c a n c e r c e l l l i n e A 5 4 9 J International Journal of Laboratory Medicine 2 0 1 6 37 7 8 6 5 8 6 7 9 B E N V E N I S T E P B i o s y n t h e s i s a n d a c c u m u l a t i o n o f s t e r o l s J Annual Review of Plant Biology 2 0 0 4 5 5 4 2 9 4 5 7 1 0 G R E B E N O K R J G A L B R A I T H D W D E L L A P E N N A D C h a r a c t e r i z a t i o n o f Zea mays e n d o s p e r m C 2 4 s t e r o l m e t h y l t r a n s f e r a s e O n e o f t w o t y p e s o f s t e r o l m e t h y l t r a n s f e r a s e i n h i g h e r p l a n t s J Plant Molecular Biology