西北植物學(xué)報(bào) 2 0 2 1 4 1 4 0 5 3 9 0 5 4 8 Acta Bot Boreal Occident Sin doi 1 0 7 6 0 6 j i s s n 1 0 0 0 4 0 2 5 2 0 2 1 0 4 0 5 3 9 h t t p x b z w x b a l l j o u r n a l n e t 收稿日期 2 0 2 1 0 1 0 4 修改稿收到日期 2 0 2 1 0 4 0 8 基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金新疆聯(lián)合基金 U 1 9 0 3 1 0 6 蔬菜資源保存與研究 K Y Z Z 2 0 2 1 0 0 4 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金 C X 2 0 3 1 0 1 江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程 P A P D 作者簡(jiǎn)介 朱珍花 1 9 9 6 女 碩士研究生 主要研究方向蔬菜生物技術(shù) E m a i l 2 0 1 8 1 0 4 0 6 9 n j a u e d u c n 通信作者 吳 震 教授 博士生導(dǎo)師 研究方向?yàn)槭卟松砼c分子技術(shù) E m a i l w z h n j a u e d u c n 番茄SlGRAS4基因特征分析和耐熱功能鑒定 朱珍花 蔣芳玲 文軍琴 石瀟瀑 吳翠云 劉 敏 吳 震 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 2 1 0 0 9 5 摘 要 G R A S轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一 而目前還沒有G R A S調(diào)控 高溫脅迫的研究 為了深入研究番茄SlGRAS4生物功能 以耐熱番茄L A 2 0 9 3為試驗(yàn)材料 分析番茄SlGRAS4 基因結(jié)構(gòu) 啟動(dòng)子序列及進(jìn)化關(guān)系 利用q R T P C R檢測(cè)SlGRAS4在不同脅迫和不同激素處理下的表達(dá)水平 利用 V I G S驗(yàn)證SlGRAS4基因耐熱功能 結(jié)果表明 1 生物信息學(xué)分析顯示 S l G R A S 4蛋白長(zhǎng)度為6 6 6 a a 分子量為 7 5 7 3 7 7 2 D a 理論等電點(diǎn)為6 3 1 含有G R A S轉(zhuǎn)錄因子家族典型的結(jié)構(gòu)域 主要集中在C末端的2 7 7 6 5 7 a a之 間 在SlGRAS4啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)脫落酸 A B A 和水楊酸 S A 響應(yīng)元件 S l G R A S 4與煙草N t G R A S 1蛋白親緣關(guān) 系最近 推測(cè)SlGRAS4可能與其同源基因具有相似的生物功能 2 在高溫 低溫 鹽和干旱脅迫處理1 2 h時(shí)番 茄SlGRAS4基因表達(dá)量升至最高 分別增加到對(duì)照的8 8 6 4 8 6 5 5 3 8和7 6 3倍 在A B A和S A激素處理8 h 時(shí)SlGRAS4基因的表達(dá)量達(dá)到峰值 分別達(dá)到對(duì)照的1 2 0 7 2和3 5 5倍 說明SlGRAS4可能參與了多種非生物 脅迫響應(yīng)和激素信號(hào)傳導(dǎo) 3 沉默SlGRAS4基因番茄植株 V S l G R A S 4 在高溫脅迫下較對(duì)照植株 V e 更容易 萎蔫 且Fv Fm與S O D P O D活性顯著降低 R E L和H 2 O 2含量顯著升高 說明在高溫脅迫下沉默SlGRAS4使番 茄植株細(xì)胞膜氧化損傷加重 光合能力降低 活性氧 R O S 清除酶活性減弱 4 q R T P C R分析顯示 V S l G R A S 4 植株中高溫信號(hào)應(yīng)答關(guān)鍵基因HsfA1b R O S信號(hào)應(yīng)答基因ZAT1 0和ZAT1 2以及R O S清除酶編碼基因CuZn SOD FeSOD APX1 APX2 CAT的表達(dá)水平均顯著低于V e植株 表明SlGRAS4轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控高溫 和R O S信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響番茄的耐熱性 研究認(rèn)為 高溫 低溫 干旱 鹽 A B A和S A均可顯著誘導(dǎo)番茄SlGRAS4 基因的表達(dá) 沉默SlGRAS4基因番茄植株的耐熱性顯著降低 證明番茄SlGRAS4基因具有耐熱功能 為進(jìn)一步解 析SlGRAS4參與番茄耐熱調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ) 關(guān)鍵詞 番茄 SlGRAS4 基因沉默 高溫脅迫 R O S清除酶 中圖分類號(hào) Q 7 8 6 Q 7 8 9文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A Identification and Heat Resistance Analysis of SlGRAS4 Gene in Tomato Z H U Z h e n h u a J I A N G F a n g l i n g W E N J u n q i n S H I X i a o p u W U C u i y u n L I U M i n W U Z h e n C o l l e a g e o f H o r t i c u l t u r e N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y K e y L a b o r a t o r y o f B i o l o g y a n d G e r m p l a s m E n h a n c e m e n t o f H o r t i c u l t u r a l C r o p s i n E a s t C h i n a M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e N a n j i n g 2 1 0 0 9 5 C h i n a Abstract G R A S t r a n s c r i p t i o n f a c t o r i s o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s f o r p l a n t s i n r e g u l a t i n g g r o w t h a n d a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e H o w e v e r t h e r e h a v e n o r e s e a r c h a b o u t G R A S r e g u l a t i n g h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s I n o r d e r t o f u r t h e r e x p l o r e t h e f u n c t i o n s o f SlGRAS4 g e n e i n t o m a t o w e u s e d h e a t r e s i s t a n t t o m a t o L A 2 0 9 3 a s t h e t e s t m a t e r i a l i d e n t i f i e d t h e g e n e s t r u c t u r e p r o m o t e r s e q u e n c e a n d e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p o f SlGRAS4 g e n e d e t e c t e d t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f SlGRAS4 g e n e u p o n a b i o t i c s t r e s s a n d h o r m o n e t r e a t m e n t s b y q R T P C R a n a l y z e d t h e f u n c t i o n o f SlGRAS4 g e n e r e s p o n d i n g t o h i g h t e m p e r a t u r e b y V I G S T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 1 b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e l e n g t h o f S l G R A S 4 p r o t e i n w a s 6 6 6 a m i n o a c i d s w i t h 7 5 7 3 7 7 2 D a m o l e c u l a r w e i g h t a n d 6 3 1 i s o e l e c t r i c p o i n t t h e t y p i c a l d o m a i n o f t h e G R A S f a m i l y w a s s p e c i f i c a l l y d e t e c t e d a t t h e C t e r m i n a l b e t w e e n 2 7 7 6 5 7 a a i n S l G R A S 4 p r o t e i n t h e e l e m e n t s r e l a t e d t o a b s c i s i c a c i d a n d s a l i c y l i c a c i d r e s p o n d i n g w e r e d e t e c t e d i n p r o m o t e r r e g i o n o f SlGRAS4 g e n e e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p a n a l y s i s s h o w e d S l G R A S 4 p r o t e i n h a s t h e n e a r e s t r e l a t i o n s h i p w i t h Nicotiana tabacum N T G R A S 1 p r o t e i n a n d p r e d i c t e d SlGRAS4 h a s s i m i l a r b i o l o g i c a l f u n c t i o n s w i t h i t s h o m o l o g o u s g e n e s 2 T h e e x p r e s s i o n o f SlGRAS4 g e n e i n t o m a t o i n c r e a s e d t o t h e h i g h e s t a n d u p r e g u l a t e d 8 8 6 4 8 6 5 5 3 8 a n d 7 6 3 f o l d s c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l a f t e r 1 2 h o f h i g h t e m p e r a t u r e l o w t e m p e r a t u r e s a l t a n d d r o u g h t s t r e s s t r e a t m e n t s r e s p e c t i v e l y a s w e l l a s r e a c h e d t h e p e a k v a l u e a f t e r 8 h o f A B A a n d S A t r e a t m e n t s w h i c h u p r e g u l a t e d 1 2 0 7 2 a n d 3 5 5 f o l d s c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l r e s p e c t i v e l y i n d i c a t i n g t h a t SlGRAS4 m a y b e i n v o l v e d i n a v a r i e t y o f a b i o t i c s t r e s s r e s p o n s e s a n d h o r m o n e s i g n a l t r a n s d u c t i o n 3 U n d e r h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s SlGRAS4 s i l e n c i n g t o m a t o p l a n t s V S l G R A S 4 w e r e w i t h e r t h a n t h e c o n t r o l p l a n t s V e a n d Fv Fm S O D a n d P O D a c t i v i t i e s w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d a n d c o n t e n t s o f R E L a n d H 2 O 2 w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n d i c a t i n g t h a t s i l e n c i n g SlGRAS4 a g g r a v a t e d o x i d a t i v e d a m a g e o f t h e c e l l m e m b r a n e a n d r e d u c e d p h o t o s y n t h e t i c c a p a c i t y a n d w e a k e n e d a c t i v i t y o f R O S s c a v e n g i n g e n z y m e i n t o m a t o p l a n t s 4 q R T P C R a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f Hs fA1b h i g h t e m p e r a t u r e s i g n a l r e s p o n s e g e n e ZAT1 0 a n d ZAT1 2 R O S s i g n a l i n g r e s p o n s e g e n e s CuZnSOD FeSOD APX1 APX2 a n d CAT R O S s c a v e n g i n g e n z y m e c o d e g e n e s w e r e a l s o s i g n i f i c a n t l y d o w n r e g u l a t e d i n V S l G R A S 4 p l a n t s T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t SlGRAS4 c a n e n h a n c e h e a t t o l e r a n c e o f t o m a t o t h r o u g h h i g h t e m p e r a t u r e a n d R O S s i g n a l t r a n s d u c t i o n T h e s t u d i e s s h o w e d t h e e x p r e s s i o n o f Sl GRAS4 g e n e w a s s i g n i f i c a n t l y i n d u c e d u n d e r h i g h t e m p e r a t u r e l o w t e m p e r a t u r e d r o u g h t s a l t A B A a n d S A a n d t h e h e a t t o l e r a n c e o f t o m a t o w a s r e d u c e d a f t e r s i l e n c i n g SlGRAS4 g e n e i n d i c a t i n g t o m a t o Sl GRAS4 g e n e h a s h e a t r e s i s t a n c e f u n c t i o n a n d t h i s w i l l l a y a f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r a n a l y s i s o f h e a t m o l e c u l a r m e c h a n i s m Key words t o m a t o SlGRAS4 V I G S h i g h t e m p e r a t u r e s t r e s s R O S s c a v e n g i n g e n z y m e s 高溫對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量均造成不利影 響 為此植物進(jìn)化形成相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 熱激轉(zhuǎn)錄因子 h e a t s h o c k t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s H s f s 和熱激蛋白 h e a t s h o c k p r o t e i n s H s p s 是高 溫脅迫響應(yīng)機(jī)制的重要組成部分 H s f s通過調(diào)控 自身及靶基因的轉(zhuǎn)錄水平來響應(yīng)高溫脅迫 1 H S P在復(fù)原熱激變性蛋白質(zhì)以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量 方面起關(guān)鍵作用 活性氧 R O S 是高溫脅迫引起 的應(yīng)激信號(hào)分子 1 植物中的R O S水平會(huì)影響 H s f s和H s p s的表達(dá) 從而對(duì)高溫脅迫做出響 應(yīng) 2 3 R O S信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子Z A T 1 0和Z A T 1 2參與 高溫逆境調(diào)節(jié) 4 5 這些發(fā)現(xiàn)表明高溫信號(hào)和R O S 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間是相互關(guān)聯(lián)的 活性氧 R O S 清除 酶是熱激誘導(dǎo)的主要功能蛋白 包括過氧化物酶 P O D 過氧化氫酶 C A T 和抗壞血酸酶 A P X 等 它們?cè)诟邷孛{迫下清除植物體內(nèi)過量產(chǎn)生的 R O S 從而減輕植物遭受的氧化傷害 1 6 除了H s f 和Z A T兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族外 目前報(bào)道參與高溫 逆境脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族還包括N A C E R F W R K Y b Z I P和M Y B等 7 G R A S是植物體內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子家族 包括3個(gè)初始成員G A I g i b b e r e l l i n a c i d i n s e n s i t i v e R G A t h e r e p r e s s o r o f G A 1 3 m u t a n t 和 S C R s c a r e c r o w 這3個(gè)成員的表達(dá)產(chǎn)物具有高度 的結(jié)構(gòu)和序列相似性 因此G R A S家族就取G A I R G A S C R的關(guān)鍵字母進(jìn)行命名 8 G R A S在植物 發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用 包括芽分生組 織狀態(tài)維持 9 腋芽分生組織進(jìn)化 1 0 配子發(fā) 生 1 1 植物鉻信號(hào)以及葉綠素a和b信號(hào)傳導(dǎo) 1 2 植物休眠 1 3 赤霉素的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 1 4 生 長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 1 5 等 G R A S家族基因在植物抵抗 非生物脅迫方面也具有重要作用 研究表明 胡楊 G R A S家族基因PeSCL7在擬南芥中的過表達(dá)株 系表現(xiàn)出更好的耐旱性和耐鹽性 1 6 過表達(dá)Os GRAS2 3水稻株系的耐旱和抗氧化能力均有增 強(qiáng) 1 7 葡萄GRAS家族基因VaPAT1在擬南芥中 的過表達(dá)株系抗旱性 抗冷性和耐鹽性均增強(qiáng) 1 8 轉(zhuǎn)核桃JrGRAS2基因酵母在3 6 脅迫下表現(xiàn)出 045西 北 植 物 學(xué) 報(bào) 4 1卷 更高的生存活性 1 9 然而G R A S家族轉(zhuǎn)錄因子是 否參與植物高溫逆境調(diào)控還缺少研究 其調(diào)控機(jī)理 更少有報(bào)道 番茄 Solanum lycopersicum L 是重要的蔬 菜作物 因其果實(shí)具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值 深受消費(fèi)者 喜愛并在全球范圍內(nèi)廣泛栽培 番茄喜溫暖 但對(duì) 高溫敏感 番茄中有5 3個(gè)G R A S家族成員 2 0 前 人利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定了該家族部分成員在番茄逆 境調(diào)控中的功能 研究表明 沉默SlGRAS6提高 了由丁香假單胞菌引起的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的發(fā)病 率 2 1 沉默SlGRAS4 3番茄植株在干旱脅迫下丙二 醛含量上升 脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性下 降 2 2 SlGRAS4 0過表達(dá)株系增強(qiáng)了番茄耐鹽和抗 旱能力 2 3 SlGRAS7過表達(dá)番茄株系表現(xiàn)出更高 的抗旱性和耐鹽性 2 4 目前 還未見GRAS家族成 員基因參與番茄耐熱調(diào)控的報(bào)道 在之前研究中 W e n等 2 5 以醋栗番茄L A 2 0 9 3 為材料通過R N A S e q分析發(fā)現(xiàn)SlGRAS4基因在 高溫脅迫后顯著誘導(dǎo)表達(dá) 推測(cè)該基因參與番茄高 溫脅迫響應(yīng) 并且可能在番茄高溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮 重要作用 為分析SlGRAS4基因特征 明確其在 番茄耐熱中的作用 本研究首先利用生物信息學(xué)分 析法預(yù)測(cè)了SlGRAS4生物功能 然后利用實(shí)時(shí)熒 光定量P C R q R T P C R 檢測(cè)其在逆境脅迫和激素 處理下的表達(dá)特征 最后利用病毒誘導(dǎo)基因沉默 v i r u s i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g V I G S 抑制該基因在 番茄植株中的表達(dá) 測(cè)定高溫處理下相關(guān)生理指標(biāo) 和基因表達(dá)量變化 鑒定SlGRAS4基因在番茄中 的耐熱功能 不僅證明了G R A S基因家族與番茄耐 熱之間的聯(lián)系 而且豐富了番茄耐高溫調(diào)控機(jī)制 1 材料和方法 1 1 植物材料和培養(yǎng)條件 試驗(yàn)材料為醋栗番茄L A 2 0 9 3 Solanum pimpinellifolium L 種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜生 理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供 番茄種子經(jīng)過浸泡和催芽處理 后播種于基質(zhì)配比為泥炭 蛭石 珍珠巖 V V V 2 1 1的7 2孔穴盤中 并放置在光培箱中培 養(yǎng) 東南儀器 R D N 5 6 0 E 4 中國 生長(zhǎng)條件為溫度 2 5 1 8 晝 夜 光周期1 4 h 1 0 h 晝 夜 光 合有效輻射為3 6 0 m o l m 2 s 1 相對(duì)濕度 7 5 沉默植株侵染后溫度調(diào)整為2 2 1 8 晝 夜 當(dāng)?shù)?片真葉完全展開后 將生長(zhǎng)一致的幼苗 移栽到3 2孔穴盤中 其中不同脅迫和激素處理的番 茄幼苗經(jīng)過洗根后移栽至無土栽培基質(zhì) 蛭石 珍 珠巖 V V 1 1 中 試驗(yàn)材料均澆1倍的田園 式營(yíng)養(yǎng)液 1 2 方 法 1 2 1 SlGRAS4生物信息學(xué)分析 利用在線網(wǎng)站 G e n e S t r u c t u r e D i s p l a y S e r v e r 2 0 h t t p g s d s c b i p k u e d u c n 比對(duì)SlGRAS4基因組D N A和 全長(zhǎng)c D N A 得到內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)圖 S l G R A S 4 蛋白質(zhì)的分子量 等電點(diǎn)等通過在線計(jì)算工具P r o t P a r a m h t t p w e b e x p a s y o r g p r o t p a r a m 獲得 S l G R A S 4蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果利用在線網(wǎng)站I n t e r P r o S c a n h t t p w w w e b i a c u k i n t e r p r o s e a r c h s e q u e n c e s e a r c h 獲取 利用P l a n t C a r e數(shù) 據(jù)庫 h t t p b i o i n f o r m a t i c s P s b U g e n t b e w e b t o o l s p l a n t c a r e h t m l 對(duì)SlGRAS4基因起始 密碼子上游2 0 0 0 b p啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析 利 用N C B I數(shù)據(jù)庫中的B l a s t p同源比對(duì)工具 搜索并 下載S l G R A S 4同源蛋白序列 利用D N A M A N 8 對(duì)S l G R A S 4及其同源蛋白進(jìn)行比對(duì)分析 構(gòu)建簡(jiǎn) 單進(jìn)化樹 通過在線工具M(jìn) E M E h t t p m e m e s u i t e o r g t o o k m e m e 獲得S l G R A S 4及其同源蛋 白保守基序 1 2 2 SlGRAS4在不同脅迫和激素處理下的表達(dá) 分析 L A 2 0 9 3生長(zhǎng)至5葉1心時(shí)進(jìn)行不同脅迫和 激素處理 對(duì)照為蒸餾水2 L P E G 6 0 0 0模擬缺水 脅迫處理 蒸餾水2 L 2 0 P E G 6 0 0 0 N a C l模擬 鹽脅迫處理 2 L蒸餾水 2 0 0 m m o l L N a C l A B A 處理 2 L蒸餾水 2 0 0 m o l L A B A S A處理 2 L 蒸餾水 2 0 0 m o l L S A 分別在處理0 4 8和1 2 h后取番茄幼苗自頂部向下數(shù)第2片完全展開真 葉 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3次生物學(xué)重復(fù) 每個(gè)重復(fù)取2株混 樣 每次取樣后的植株不再用于重復(fù)取樣 取樣后利 用液氮速凍并保存至 8 0 超低溫冰箱 利用T r i z o l 試劑盒 I n v i t r o g e n 美國 提取各樣 品總R N A 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)R N A樣本完整 性 N a n o D r o p 2 0 0 0紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其濃 度及純度 利用5 A l l I n O n e R T M a s t e r M i x反 轉(zhuǎn)錄試劑盒 A b m 加拿大 完成 c D N A 合成和純 化 SlGRAS4的q P C R引物 表1 引用于q P r i m e r D B數(shù)據(jù)庫 h t t p s b i o d b s w u e d u c n q p r i m e r d b 利用T O R O G r e e n q P C R M a s t e r M i x 試劑 盒 T o r o i v d 英國 在Q u a n t s t u d i o 3實(shí)時(shí)熒光定量 P C R儀 A p p l i e d B i o s y s t e m s 美國 上按說明進(jìn)行 1454期 朱珍花 等 番茄SlGRAS4基因特征分析和耐熱功能鑒定 P C R試驗(yàn) 反應(yīng)體系 5 L T O R O G r e e n q P C R M a s t e r M i x 1 L c D N A模板 上下游引物各0 4 L 3 2 L d d H 2 O 反應(yīng)程序 9 5 預(yù)變性6 0 s 9 5 變性1 0 s 6 0 退火3 0 s 7 2 延伸3 0 s 4 0個(gè) 循環(huán) 進(jìn)行熔解曲線分析 范圍為6 0 9 5 以驗(yàn) 證每個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增特異性 Actin作為內(nèi)參基因 通過2 C T計(jì)算SlGRAS4基因相對(duì)表達(dá)量 1 2 3 VSlGRAS4植株獲取 利用S o l G e n o m i c s N e t w o r k h t t p s s o l g e n o m i c s n e t 中V I G S T o o l 工具選取SlGRAS4基因C D S區(qū)5 0 0 b p序列作為 沉默片段 利用諾唯贊公司 南京 中國 C E D e s i g n V 1 0 4軟件單片段克隆法設(shè)計(jì)正反向5 端引入線 性化載體兩末端同源序列的引物 表1 以L A 2 0 9 3 葉片的c D N A為模板克隆該沉默片段并測(cè)序 用 限制性內(nèi)切酶Xba H F和Kpn N E B 中國 將 T R V 2載體線性化 利用同源重組試劑盒C l o n e E x p r e s s O n e S t e p C l o n i n g K i t 諾唯贊 南京 將其 與測(cè)序結(jié)果正確的SlGRAS4沉默序列連接 并轉(zhuǎn) 化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞D H 5 菌落經(jīng)P C R鑒定 后 進(jìn)一步測(cè)序獲得正確陽性克隆 提取陽性克隆 中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌G V 3 1 0 1 即得到陽性工程菌 分別將農(nóng)桿菌p T R V 1 p T R V 2 p T R V 2 SlGRAS4 單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并重懸于滲透緩沖液 1 0 m m o l L 1 M g C l 2 1 0 m m o l L 1 M E S 2 0 0 m o l L 1 A S p H 5 6 中 調(diào)節(jié)緩沖液中菌液O D 6 0 0為1 0 室 溫黑暗靜置3 h 將含有p T R V 1農(nóng)桿菌的滲透液 分別與含有p T R V 2 p T R V 2 SlGRAS4農(nóng)桿菌的滲 透液按1 1比例混合配置成侵染液 待醋栗番茄 L A 2 0 9 3幼苗第1片真葉顯現(xiàn)時(shí) 用1 m L注射器將 配置好的侵染液注射到番茄子葉中 其中p T R V 1 農(nóng)桿菌和p T R V 2農(nóng)桿菌混合侵染植株作為對(duì)照植 株 V e m p t y V e p T R V 1農(nóng)桿菌和p T R V 2 Sl GRAS4農(nóng)桿菌混合侵染植株作為沉默植株 V S l G R A S 4 并于接種第2 0天取第2片葉檢測(cè)Sl GRAS4的表達(dá)量 1 2 4 VSlGRAS4植株耐高溫能力鑒定 V e植株 和V S l G R A S 4植株生長(zhǎng)至5葉1心時(shí) 對(duì)其進(jìn)行高 溫 4 0 4 0 晝 夜 處理和相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 在 高溫處理0 1 2 2 4 h時(shí) 從上往下數(shù)取第3片葉測(cè) 定過氧化氫 H 2 O 2 含量和光系統(tǒng) 最大光化學(xué)量 子產(chǎn)量 Fv Fm 取第4片葉測(cè)定電導(dǎo)率 R E L 在 高溫處理0 4 8 h時(shí) 從上往下數(shù)取第2片葉測(cè)定 基因表達(dá)量 取第3片葉測(cè)定S O D P O D A P X活 性 R E L和Fv Fm測(cè)定使用新鮮樣品 其他樣品 取樣后立即用液氮速凍并儲(chǔ)存在 8 0 超低溫冰 箱 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定均 3次生物學(xué)重復(fù) 每個(gè)重復(fù) 取2株混樣 每次取樣后的植株不再用于重復(fù)取樣 R E L的測(cè)定參照C a o等報(bào)道的方法 2 6 Fv Fm 表1 本研究所用引物 T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y 基因 G e n e I D I d e n t i t y 上游序列 F o r w a r d s e q u e n c e 5 3 下游序列 R e v e r s e s e q u e n c e 5 3 作用 F u n c t i o n V GRAS4 S o l y c 0 1 g 1 0 0 2 0 0 2 a a g g t t a c c g a a t t c t c t a g a g a g a c g c g t g a g c t c g g t a c c A A G A A A G A G T A T G G A A G C C C T T T T T C A A G A A C A C A T G A T T A G A T A A A G T G G A 基因克隆 G e n e c l o n e GRAS4 S o l y c 0 1 g 1 0 0 2 0 0 2 T T C C C C A G C C A G G T T T C A A G G C G T G A T G C T T T C C C A C T T C HSFA1aS o l y c 0 8 g 0 0 5 1 7 0 2 G T C G T G G A G T C C T A C G A A T A A T C A T A A G T A T T C A G C T G C C G A A C HSFA1bS o l y c 0 3 g 0 9 7 1 2 0 2 T T G T C T C T G A T G A A T T T T C G G C G A G A T C C T C T T C C A C G A C T A A G HSP9 0 S o l y c 0 6 g 0 3 6 2 9 0 2 G C A C T T C T C T G T T G A A G G T C A G A T G A A C A C A C G G C G A A C A T A Cu Zn SODS o l y c 1 1 g 0 6 6 3 9 0 1 G G C C A A T C T T T G A C C C T T T A A G T C C A G G A G C A A G T C C A G T FeSODS o l y c 0 6 g 0 4 8 4 1 0 2 G G G A A G C A T C A C A G G G C G T A T G G G C T C T C C T C C T C C G T T G G CATS o l y c 1 2 g 0 9 4 6 2 0 1 C C C A G T T A A T G C T C C C A A G T A G G A C G A C A A G G A T C A A A C C APX1 S o l y c 0 6 g 0 0 5 1 6 0 2 T G C T G G T A C C T A C G A T G T G T G C T G G T G G C T C T G G C T T G T C APX2 S o l y c 0 6 g 0 0 5 1 5 0 2 G G C T G G T G T T G T T G C T G T T G T C A G G C A A G C G A C C T T C A A C ZAT1 2 S o l y c 0 6 g 0 7 5 7 8 0 2 G C C A T C G A A C G A G T C A T A A A T C C C T G A C C C A T A G A A A A C T C C A T ZAT1 0 S o l y c 0 4 g 0 7 7 9 8 0 1 G C A A A C G T T T C A A T T T G A G A G C C G T G A C C T C T T A G A T C T C T T C C ActinS o l y c 0 4 g 0 1 1 5 0 0 2 G T G A A A G A A A A G C T C G C T T A C A G C T C A T A G C T C T T C T C A A C A G A q R T P C R 245西 北 植 物 學(xué) 報(bào) 4 1卷 利用便攜式熒光儀測(cè)量 H 2 O 2含量測(cè)定參照U c h i d a等報(bào)道的方法 2 7 S O D P O D和A P X活性測(cè)定 參照B e y e r和N a k a n o等報(bào)道的方法 2 8 2 9 1 2 5 VSlGRAS4植株高溫和ROS信號(hào)應(yīng)答基因 表達(dá)量分析 將樣品從超低溫冰箱中取出 參考 1 2 2 方法完成總 R N A提取和反轉(zhuǎn)錄 Actin作為 內(nèi)參基因 高溫信號(hào)應(yīng)答基因HsfA1a HsfA1b Hsp9 0和R O S信號(hào)應(yīng)答基因ZAT1 0 ZAT1 2 CuZnSOD FeSOD CAT APX1 APX2定量引物 引用于q P r i m e r D B數(shù)據(jù)庫 表1 利用上述相同 P C R體系和程序完成試驗(yàn) 通過2 C T法計(jì)算各基 因的相對(duì)表達(dá)量 1 3 數(shù)據(jù)處理 測(cè)定結(jié)果均為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值 S E 利用S P S S 2 5 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和差異顯 著性比較 2 結(jié)果與分析 2 1 SlGRAS4生物信息學(xué)分析 為研究SlGRAS4基因特征和生物功能 本研 究對(duì)SlG