果 樹 資 源學(xué)報 一 株 兼 具 降 解 纖 維 素 和 抗 草 莓 重 茬 病 害 能 力 細(xì) 菌 的 篩 選 和 應(yīng) 用 肖 蓉 鄧 舒 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所 山西太原 收 稿 日 期 第 一 作 者 簡 介 肖 蓉 女 碩士研究生 副研究員 主要從事園藝植物重茬障礙生物防治的研究 摘 要 從腐熟牛糞中篩選兼具降解纖維素功能和抗草莓重茬病害功能的細(xì)菌 為草莓夏季高溫悶 棚時提供菌種資源 結(jié)果 篩選出 株有纖維素降解功能的細(xì)菌 水解圈直徑達(dá) 對草 莓灰霉菌 鐮刀菌和擬盤多毛孢菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈拮抗作用 離體葉片實驗中 對草莓灰霉病的防效達(dá) 盆栽試驗也驗證了 對草莓灰霉病有較高的防效 經(jīng)形態(tài)特征 生理生化特征和 測 序 被鑒定為解淀粉芽孢桿菌 關(guān) 鍵 詞 纖維素降解 重茬病害 草莓 生物防治 文 章 編 號 中 圖 分 類 號 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識 碼 I s o l a t i onandA pp l i c a t i ono fBa c t e r i umwi t h Re s i s t i n g S t r awb e r r y Re p l an tDi s e a s e sandCe l l u l o s eDe g r ad i n g Ab s t r a c t o t ry t i s i n e r e a u s ar i umsp e s t a l o t i ops i ssp o t ry t i s i n e r e a a c i l l u s my l o l i qu efa c i e n s Ke ywo r d s 在生產(chǎn)上 為了保證優(yōu)質(zhì)高產(chǎn) 設(shè)施栽培草莓每 年都換新苗 重茬問題在所難免 重茬病害嚴(yán)重成為 草莓設(shè)施栽培中的一大難題 近幾年 隨著高溫悶 棚技術(shù)的普及 多數(shù)果農(nóng)均會在 月對草莓大棚 進(jìn)行高溫悶棚殺菌 以減輕土壤中病原菌基數(shù) 研究指出 悶棚時將秸稈 蘑菇菌渣 牛糞等有機(jī)物 一起施入土壤 既可以提高地溫 又可以增加土壤肥 力 殺菌 殺蟲與施肥同步進(jìn)行 一舉多得 但 是由于各地每年的氣溫條件都不一樣 如果在悶棚 期間遇到連日陰天 則施加的秸稈 蘑菇菌渣等有機(jī) 物不能充分腐熟 就會影響新栽的草莓苗生長 因 此 為了保證有機(jī)物的充分腐熟以及病原菌的消殺 人們在高溫悶棚時需分別添加具有纖維素降解功能 和病害拮抗功能的生物菌劑 本試驗研究旨在篩 選一種兼具纖維素降解功能和草莓病害拮抗功能的 細(xì)菌 以使生產(chǎn)中進(jìn)行高溫悶棚時更便捷高效 材料與方法 細(xì) 菌 的 篩 選 初篩 以能夠產(chǎn)生纖維素降解酶為初篩指標(biāo) 以腐熟牛糞為原材料 將 牛糞放入 無菌 水中 充分震蕩混勻 然后梯度稀釋到 濃度 取 濃度的稀釋液 涂布在羧 甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基上 黑暗條件倒置培 養(yǎng) 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基配方為 羧甲基纖維素 鈉 酵母粉 磷酸二氫鉀 硝酸銨 硫酸鎂 待單菌落長出后 挑取單 菌落接種于新的羧甲基纖維素鈉固體平板 恒溫培養(yǎng) 剛果紅染色 篩選出透明圈較大的 菌落 編號 轉(zhuǎn)移到新的平板上 多次劃線培養(yǎng)純化 后接于羧甲基纖維素鈉固體斜面上 保存用于 后續(xù)試驗 復(fù)篩 采用平板對峙培養(yǎng)方法 以本實驗室保存 的常見草莓病原菌灰霉菌 鐮刀菌和擬盤多毛孢菌 為靶標(biāo)菌進(jìn)行復(fù)篩 取病原菌菌絲接種于 固 體培養(yǎng)基平板中央 按等邊三角形 個頂點的方向 將初篩細(xì)菌接種于病害菌周圍 于 條件下黑暗 倒置培養(yǎng) 以只接種病害菌 不接種細(xì)菌的平板作 為對照 以后觀察病害菌生長狀況 細(xì) 菌 鑒 定 參考 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊 方法進(jìn)行生理 生化鑒定 分子鑒定 挑取細(xì)菌單菌落接于 液體培養(yǎng)基 中 搖床培養(yǎng)過夜 取 菌液 離心 棄上清 于沉淀中加入 滅菌超純 水 充分混勻后 置于 水浴 裂解 裂解 液作為模板進(jìn)行 反應(yīng) 引物為通用引物 和 由生工生物工程 上海 股份有限公 司合成 引物序列為 和 體系為 上下游引物各 模板 酶 加水補(bǔ)齊至 程序 為 個循環(huán) 產(chǎn)物經(jīng) 瓊脂糖 凝膠電泳檢測后送往北京華大生物工程技術(shù)有限公 司測序 測序結(jié)果經(jīng) 網(wǎng)頁 比對獲知菌 株的分子鑒定結(jié)果 菌 株 對 草 莓 灰 霉 病 的 防 治 草 莓 活 體 組 織 測 試 采用葉片法測定細(xì)菌發(fā)酵原液對草莓灰霉病的 防效 將生長健康 大小一致的草莓葉片從葉柄處 剪斷 用自來水將葉片表面沖洗干凈 再用 乙 醇進(jìn)行表面消毒 用滅菌水沖洗干凈后 在 發(fā) 酵液中浸漬 晾干 葉面朝上放于鋪有無菌濾 紙保濕的培養(yǎng)皿內(nèi) 葉柄用浸濕的滅菌棉球包裹 采取牙簽劃傷接種的方式將灰霉菌菌絲接種到葉片 上 以無菌水代替發(fā)酵液做對照 每組葉片共有 片 實驗 以后進(jìn)行病害調(diào)查 根據(jù)每片葉 子的變褐情況以目測法對病情進(jìn)行記載 草莓葉部病害病級按 級劃分 級 無病 級 發(fā)病面積占葉表面積 以下 級 發(fā)病面積占葉表面積 級 發(fā)病面積占葉表面積 級 發(fā)病面積占葉表面積 以上 病情指數(shù) 每一級的級值 該級的葉片數(shù) 總?cè)~片數(shù) 最大級值 草 莓 盆 栽 測 試 采用盆栽灌根法進(jìn)行 取處于苗期的生長健壯 無病草莓苗為試材 將細(xì)菌接種于羧甲基纖維素鈉 培養(yǎng)基中 培養(yǎng) 后作為供試發(fā)酵原液 將 草莓灰霉病菌接種于 液體培養(yǎng)基中 搖 床培養(yǎng) 后備用 實驗組和對照組各設(shè)置 次重 復(fù) 每盆種植一株健康 且長勢一致的草莓苗 實驗 組中 在草莓苗根部開溝 將培養(yǎng)好的細(xì)菌發(fā)酵液倒 入溝內(nèi) 待菌液被土壤全部吸收 后 倒入灰霉 菌菌懸液 再覆蓋溝槽 對照組中 以無菌水替代細(xì) 菌發(fā)酵液 其余步驟相同 用保鮮膜覆蓋土壤以利 于保濕 其余澆水等按常規(guī)管理方式管理 結(jié)果與分析 菌 株 篩 選 從腐熟牛糞中分離出 株有纖維素降解功能 的細(xì)菌 經(jīng)復(fù)篩獲得 株透明圈較大的菌株 培養(yǎng) 時菌落直徑 為 水解圈直徑 為 值達(dá) 編號為 如圖 所示 圖 剛 果 紅 染 色 圖 菌 株 對 病 原 菌 的 平 板 拮 抗 效 果 從圖 中可以明顯看出 與對照相比 當(dāng)在培養(yǎng) 基上同時接種 時 草莓灰霉菌 鐮刀菌和擬盤 多毛孢菌生長明顯受到抑制 說明 對這 種常 見草莓病原菌有強(qiáng)烈的拮抗作用 菌 株 鑒 定 菌 株 形 態(tài) 及 生 理 特 征 果 樹 資 源學(xué)報 圖 與 草 莓 病 害 的 平 板 拮 抗 效 果 注 分別為灰霉菌 鐮刀菌和擬盤多毛孢菌 在羧甲基纖維素鈉固體平板上的培養(yǎng)特征 為 菌落邊緣不整齊 呈放射狀 直徑 淺黃 色 不透明 表面濕潤 圖 采用簡單染色和革蘭 氏染色觀察 細(xì)胞形態(tài) 發(fā)現(xiàn)該菌革蘭氏染色呈 陽性 桿狀 單個 成對或成串出現(xiàn) 有芽孢 芽孢囊 不膨大 芽孢橢圓形 中生 圖 的部分生理 生化特征見表 圖 菌 株 形 態(tài) 特 征 表 菌 株 的 生 理 生 化 指 標(biāo) 指標(biāo) 結(jié)果 指標(biāo) 結(jié)果 革蘭氏染色 水解淀粉實驗 接觸酶實驗 甲基紅實驗 葡萄糖實驗 明膠液化實驗 阿拉伯糖實驗 產(chǎn)硫化氫實驗 甘露醇實驗 檸檬酸實驗 注 陽性 陰性 圖 菌 株 顯 微 形 態(tài) 圖 菌 株 的 分 子 鑒 定 菌株 的序列長度為 使用 的 工具對 菌株的 序列進(jìn)行 同源性比對 結(jié)果顯示 與解淀粉芽孢桿菌 的 相似度達(dá) 根據(jù)對菌株的形態(tài)學(xué) 培養(yǎng)特征 生理生化和分 子鑒定的研究結(jié)果 菌株 鑒定為解淀粉芽孢桿 菌 解淀粉芽孢桿菌 在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心保藏 保藏登記號為 對 草 莓 灰 霉 病 的 防 治 選擇灰霉菌作為靶標(biāo)菌進(jìn)一步驗證 的實 際應(yīng)用效果 離體草莓葉片接種實驗結(jié)果見圖 可見 只接種灰霉菌的對照組 幾乎全部染病 葉片 出現(xiàn)茶褐色病斑 病斑逐漸擴(kuò)大 后 有的整片 葉子均變?yōu)椴韬稚?且表面覆蓋一層灰褐色菌絲 病 情指數(shù)達(dá) 實驗組葉片先經(jīng) 處理后再 接種 后 僅有少量葉片出現(xiàn)茶褐色病斑 病情指數(shù)僅為 說明 對草莓灰霉病具有 較高的防效 圖 對 灰 霉 病 的 防 效 為了檢驗 在實際土壤環(huán)境下對 病的 防效 我們設(shè)置了盆栽試驗 將處理后的草莓苗在 條件下培養(yǎng) 以后 發(fā)現(xiàn)不加 發(fā)酵液 的對照組葉片有褐色斑點 葉緣發(fā)黃褐化 甚至整片 肖 蓉等 一株兼具降解纖維素和抗草莓重茬病害能力細(xì)菌的篩選和應(yīng)用 葉子干枯 而用 發(fā)酵液處理過的試驗組葉片 不見斑點和黃化 表現(xiàn)正常 圖 說明在盆栽條 件下 發(fā)酵液也表現(xiàn)出對灰霉病的防治作用 圖 防 治 灰 霉 病 的 盆 栽 實 驗 討論與結(jié)論 鐮刀菌屬真菌 u s ar i um 在世界范圍內(nèi)分 布廣泛 它可危害多種植物 破壞植物的維管束系 統(tǒng) 引起植物萎蔫死亡和器官腐爛 是生產(chǎn)上防治最 艱難的土傳病害之一 在草莓上可引起枯萎病 使草莓根部維管束變褐 葉片卷縮 萎蔫直至全株死 亡 擬盤多毛孢屬 e s t a l o t i ops i s 是著名的植 物病原體品種 在草莓上能引起葉斑病 主要危害 葉片 起初產(chǎn)生紅褐色病斑 后中央變?yōu)闇\褐色 產(chǎn) 生輪紋 邊緣出現(xiàn)明顯的暗褐色壞死帶 嚴(yán)重時葉片 枯死 灰霉病在草莓生長期 花期 果期均有可能發(fā) 生 病原菌為灰葡萄孢霉 o t ry t i s i ne r ea 其菌 絲 菌核及分生孢子可以在土壤或病殘體上越冬或 越夏 是草莓最嚴(yán)重的土傳病害之一 本研究中 分離出的 菌株對上述 種病原菌均表現(xiàn)出強(qiáng) 烈拮抗作用 因此 可以在下一步考慮將 作為 草莓專用生防菌劑 因其還兼具纖維素降解功能 故在高溫悶棚時 只施加 一種菌劑 就可以同 時滿足腐熟有機(jī)物及消殺病原菌功能 但還需在下 一步試驗中優(yōu)化 的產(chǎn)酶條件 以提高纖維素降 解功能 總之 本試驗從腐熟牛糞中分離出 株有纖維 素降解功能的細(xì)菌 水解圈直徑達(dá) 在平 板上 對草莓灰霉菌 鐮刀菌和擬盤多毛孢菌表 現(xiàn)出強(qiáng)烈拮抗作用 離體葉片實驗中 草莓灰霉病病 情指數(shù)達(dá) 試驗組葉片病情指數(shù)僅為 對草莓灰霉病的防效達(dá) 盆栽試驗也驗證 了 對草莓灰霉病有較高的防效 經(jīng)形態(tài)特征 生理生化特征和 測序 被鑒定為解 淀粉芽孢桿菌 參 考 文 獻(xiàn) 鄧亞利 設(shè)施草莓病蟲害綠色防控技術(shù) 西北園藝 綜 合 董海龍 路 平 張作剛 等 秸稈 石灰氮 菌肥 高溫悶棚處理對根結(jié)線蟲種群數(shù)量變化的影響 中 國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 楊海燕 王周平 妙曉莉 高溫悶棚改良技術(shù)在蔬菜日光 溫室中的應(yīng)用 中國瓜菜 陳 瑤 設(shè)施蔬菜高溫悶棚與秸稈還田技術(shù) 四川農(nóng) 業(yè)科技 何志剛 婁春榮 董 環(huán) 等 秸稈還田與高溫悶棚對設(shè)施 連作土壤微生境及番茄生長發(fā)育的影響 河南農(nóng)業(yè)科 學(xué) 周桂麗 棚室草莓解決重茬障礙的有效途徑 中國果 菜 東秀珠 蔡妙英 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊 北京 科學(xué) 出版社 雷恒樹 華戰(zhàn)迎 范靈姣 等 北京地區(qū)草莓枯萎病病原的 鑒定與防治 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 趙景楠 馬 喆 劉正坪 等 草莓?dāng)M盤多毛孢葉斑病的病 原菌 菌物學(xué)報 楊恩到 汪德志 陳叢良 等 大棚草霉灰霉病發(fā)生規(guī)律 及綠色防控技術(shù) 湖北植保 果 樹 資 源學(xué)報