ICS 65 020 20 B 21 DB33 浙江省 地方標(biāo)準(zhǔn) DB33 T 594 2017 代替 DB33 594 1 2005 DB33 T 594 2 2005 草莓脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 Technical regulation for virus free plantlets of strawberry 2017 02 10 發(fā)布 2017 03 10 實(shí)施 浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布 DB33 T 594 2017 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù) GB T 1 1 2009 給出的規(guī)則起草 本標(biāo)準(zhǔn)代替 DB33 594 1 2005 草莓脫毒種苗 第 1部分 脫毒種苗 和 DB33 T 594 2 2005 草莓 脫毒種苗 第 2部分 生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 本標(biāo)準(zhǔn)以 DB33 594 1 2005為主 整合了 DB33 T 594 2 2005的 部分內(nèi)容 與 DB33 594 1 2005相比 除編輯性修改外主要變化如下 修改了草莓脫毒苗 脫毒組培瓶苗 脫毒原種苗 等 術(shù)語和定義 見 3 2005年版的 3 增加了生產(chǎn)技術(shù) 見 4 修改了脫毒種苗的脫毒檢測(cè)方法 見附錄 A 2005年版的 6 修改了 脫毒組培瓶苗 脫毒種苗的質(zhì)量要求 檢測(cè)規(guī)則 見附錄 B 2005年版的 5 1 5 2和 7 本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)廳提出 本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省種植業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口 本 標(biāo)準(zhǔn)起草單位 浙江大學(xué) 建德市農(nóng)業(yè)技術(shù)推 廣中心 本 標(biāo)準(zhǔn)主要起草人 毛碧增 張國芳 孔樟良 龔鶯 張亞惠 趙玲玲 鄭銘潔 本標(biāo)準(zhǔn)為第 一 次修訂 DB33 T 594 2017 1 草莓脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了草莓脫毒苗的術(shù)語和定義 生產(chǎn)技術(shù) 分類與分級(jí) 檢測(cè)方法 質(zhì)量要求和包裝 標(biāo) 志 運(yùn)輸與貯存 本標(biāo)準(zhǔn)適用于通過組織培養(yǎng)技術(shù)培育的不攜帶草莓斑駁病毒 Strawberry mottle virus SMoV 草莓輕型黃邊病毒 Strawberry mild yellow edge virus SMYEV 草莓鑲脈病毒 Strawberry vein banding virus SVBV 和草莓皺縮病毒 Strawberry crinkle virus SCV 的脫毒組培瓶苗 脫毒原 原種苗 脫毒原種苗及脫毒生產(chǎn)用苗 2 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的 凡是注日期的引用文件 僅所注日期的版本適用于本文 件 凡是不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改單 適用于本文件 GB T 191 包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志 GB Z 26575 草莓生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范 NY T 401 2000 脫毒馬鈴薯種薯 苗 病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程 SN T 2122 進(jìn)出 境植物 及植物產(chǎn)品 檢疫抽樣 3 術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn) 3 1 草莓脫毒苗 通過植物脫病毒方法獲得或引進(jìn) 經(jīng)檢測(cè)后確認(rèn)不攜帶本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測(cè)病毒的種苗 3 2 脫毒組培瓶苗 通過植物脫病毒方法獲得的不攜帶本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測(cè)病毒的組織培養(yǎng)瓶苗 3 3 脫毒原原種苗 脫毒組培瓶苗移栽于無草莓病源 蟲源的種苗圃內(nèi)存活的植株 3 4 脫毒原種苗 DB33 T 594 2017 2 脫毒原原種苗定植于無草莓病源 蟲源的種苗圃內(nèi) 由匍匐莖繁殖的植株 3 5 脫毒生產(chǎn)用苗 脫毒原種苗定植于無草莓病源 蟲源的種苗圃內(nèi) 由匍匐莖繁殖的植株 3 6 脫毒率 不攜帶本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢測(cè)病毒的 植株數(shù)占所檢測(cè)植株總數(shù)的百分比 4 生產(chǎn)技術(shù) 4 1 脫毒組培瓶苗生產(chǎn)技術(shù) 4 1 1 外植體選擇 采樣最佳時(shí)間為 3 月 5 月晴天的 10 00 16 00 選擇品種特性純正 豐產(chǎn)性能好 品質(zhì)優(yōu)良 無 病蟲害的植株 切取帶生長點(diǎn)的匍匐莖段 5 cm 6 cm 4 1 2 無菌苗繁育 匍匐莖段經(jīng)無菌水清洗后置于超凈工作臺(tái) 切取帶生長點(diǎn)的莖段 1 cm 2 cm 用 70 75 的乙醇沖 洗表面 30 s 然后經(jīng)次氯酸鹽和 Tween 20消毒 8 min 10 min 并不斷搖動(dòng) 最后用無菌水沖洗 5 次 8 次 用無菌濾紙吸干水分 剝?nèi)?0 5 mm 1 0 mm的莖尖分生組織 接種于誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基中 4 1 3 脫毒苗培育 不定芽培養(yǎng)至 1 0 cm 1 5 cm時(shí) 置于解剖鏡下挑取 0 2 mm 0 3 mm的莖尖分生組織 接種于誘導(dǎo)不 定芽培養(yǎng)基中 不定芽長至 1 5 cm 2 0 cm時(shí)分株 單株接種于生根培養(yǎng)基 4 1 4 脫毒苗快繁 經(jīng)病毒檢測(cè)合格的試管苗 接種到增殖培養(yǎng)基中 增殖培養(yǎng)每 20 d 30 d繼代一次 總繼代次數(shù)不 超過 6代 4 1 5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)條件白天溫度 25 2 光照強(qiáng)度 30 molm 2s 1 60 molm 2s 1 晚上溫度 18 2 黑暗 培養(yǎng) 每天照光 12 h 14 h 4 2 脫毒原原種苗 脫毒原種苗和脫毒生產(chǎn)用苗生產(chǎn)技術(shù) 4 2 1 脫毒原原種苗生產(chǎn) 打開脫毒瓶苗的瓶蓋 常溫弱光照條件下馴化 1 d 2 d后洗凈瓊脂 種植于 營養(yǎng)缽或 36 孔 穴盤中 栽 后 澆透水 第一周要遮蔭 并保持濕度 75 90 建議使用防蟲網(wǎng)隔離 提倡消毒基質(zhì) 以防再度感 染病毒 4 2 2 脫毒原種苗繁殖 DB33 T 594 2017 3 4 2 2 1 苗床準(zhǔn)備 草莓忌連作 選用前作為稻或休閑空地作專用種苗地繁育 定植前施足基肥 每 667 m2 畝 施入 腐熟的有機(jī)肥 2 000 kg 氮 磷 鉀 15 15 15 三元復(fù)合肥 20 kg 苗地按畦寬 1 2 m 1 5 m 溝寬 35 cm 深 25 cm 整地作畦 4 2 2 2 定植方式 種性 純正的脫毒 原 原種苗 定植在畦中間 株距 100 cm 150 cm 植株栽植的合理深度是苗心莖部與 地面平齊 做到 深不埋心 淺不露根 建議使用防蟲網(wǎng)隔離 提倡消毒基質(zhì) 以防再度感染病毒 4 2 2 3 栽培 管理 按照 GB Z 26575的規(guī)定執(zhí)行 4 2 3 脫毒生產(chǎn)用苗繁殖 4 2 3 1 苗床準(zhǔn)備 草莓忌連作 選用前作為稻或休閑空地作專用種苗地繁育 定植前施足基肥 每 667 m2 畝 施入 腐熟的有機(jī)肥 2 000 kg 氮 磷 鉀 15 15 15 三元復(fù)合肥 20 kg 苗地按畦寬 1 2 m 1 5 m 溝 寬 35 cm 深 25 cm 整地作畦 4 2 3 2 定植方式 種性 純正的脫毒 原 種苗 定植在畦中間 株距 100 cm 150 cm 植株栽植的合理深度是苗心莖部與地 面平齊 做到 深不埋心 淺不露根 4 2 3 3 栽培 管理 按照 GB Z 26575的規(guī)定執(zhí)行 5 分類與分級(jí) 5 1 脫毒苗按繁育過程可分為脫毒組培瓶苗 脫毒原原種苗 脫毒原種苗和脫毒生產(chǎn)用苗四類 5 2 脫毒組培瓶苗按質(zhì)量要求分為優(yōu)質(zhì)苗和合格苗 6 抽樣與檢測(cè)方法 6 1 抽樣方法 按照 SN T 2122的規(guī)定執(zhí)行 6 2 抽樣 比例 按照 SN T 2122的規(guī)定執(zhí)行 6 3 檢測(cè)方法 病毒檢測(cè)方法 見附錄 A DB33 T 594 2017 4 7 質(zhì)量要求 脫毒組培瓶苗 脫毒種苗的質(zhì)量等級(jí)指標(biāo) 檢驗(yàn)方法 檢驗(yàn)規(guī)則 見附錄 B 8 包裝 標(biāo)志 運(yùn)輸與貯存 8 1 包裝 組培瓶苗和脫毒種苗宜用塑料箱或紙板箱包裝 8 2 標(biāo)志 包裝箱內(nèi)附脫毒苗出廠 圃 合格證 病毒檢測(cè)報(bào)告 見 附錄 C 外面應(yīng)注明標(biāo)準(zhǔn)號(hào) 生產(chǎn)單位 的地址和聯(lián)系電話 其他按 GB T 191的規(guī)定執(zhí)行 8 3 運(yùn)輸 運(yùn)輸過程中注意保溫保濕 溫度以 15 30 為宜 濕度以 60 90 為宜 8 4 貯存 組培瓶苗常溫弱光照條件下可以貯存 7 d 脫毒種苗出圃后 3 d內(nèi)定植 DB33 T 594 2017 5 A A 附 錄 A 資料性附錄 草莓脫毒種苗病毒檢測(cè)方法 A 1 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法 DAS ELISA 檢測(cè)方法按 NY T 401 2000中附錄 A的方法執(zhí)行 A 2 分子生物學(xué)聚合酶鏈檢測(cè)法 PCR A 2 1 草莓斑駁病毒 草莓斑駁病毒是 RNA病毒 取各編號(hào)株的葉片 提取總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA后進(jìn)行 PCR檢測(cè) 利用引 物 上游引物 5 TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG 3 和下游引物 5 TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG 3 94 預(yù)變性 3 min后 進(jìn)入循環(huán) 94 變性 30 s 54 退火 40 s 72 延伸 45 s 35 個(gè)循環(huán) 最后 72 延伸 10 min 擴(kuò)增得到 219 bp的片段 A 2 2 草莓輕型黃邊病毒 草莓輕型黃邊病毒是一種單鏈線形正義 RNA病毒 取各編號(hào)株的葉片 提取總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后進(jìn)行 PCR檢 測(cè) 利用引物 上游引物 5 GTGTGCTCAATCCAGCCAG 3 和下 游引物 5 CATGGCACTCATTGGAGCTGGG 3 94 預(yù)變性 3 min后進(jìn)入循環(huán) 94 變性 30 s 54 退火 40 s 72 延伸 45 s 35 個(gè)循環(huán) 最后 72 延伸 10 min 擴(kuò)增得到 271 bp的片段 A 2 3 草莓鑲脈病毒 草莓鑲脈病毒是一種 DNA病毒 取各編號(hào)植株的葉片 提取基因組 DNA 進(jìn)行 PCR檢測(cè) 利用引物 上 游引物 5 GAATGGGACAATGAAATGAG 3 和下游引物 5 GTGAGGAGAACTTAGGACA 3 94 預(yù)變性 3 min后進(jìn)入循環(huán) 94 變性 30 s 54 退火 40 s 72 延伸 45 s 35 個(gè)循環(huán) 最后 72 延伸 10 min 擴(kuò)增得到 574 bp的片段 A 2 4 草莓皺縮病毒 草莓皺 縮病毒是單鏈線形負(fù)義 ssRNA病毒 取各編號(hào)株的葉片 提取總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA后進(jìn)行 PCR 檢測(cè) 利用引物 上游引物 5 CATTGGTGGCAGACCCATCA 3 和下游引物 5 TTCAGGACCTATTTGATGACA 3 94 預(yù)變性 3 min后進(jìn)入循環(huán) 94 變性 30 s 54 退火 40 s 72 延伸 45 s 35 個(gè)循環(huán) 最后 72 延伸 10 min 擴(kuò)增得到 345 bp的片段 A 3 電鏡檢測(cè)法 A 3 1 檢測(cè)程序 電鏡檢測(cè)法主要用于檢測(cè)草莓斑駁病毒 草莓輕型黃邊病毒 草莓鑲脈病毒和草莓皺 縮病毒 病葉浸蘸負(fù)染色法 用研缽將病葉組織充分研磨 組織汁液經(jīng) 2 的磷鎢酸 pH值 6 8 負(fù)染色 在 透射電鏡下觀察病毒顆粒 DB33 T 594 2017 6 病葉組織超薄切片法觀察 將病葉片切成 1 mm2 2 mm2小塊 用 2 5 戊二醛及 2 四氧化鋨固定 乙醇 系列脫水 Epon 812環(huán)氧樹脂包埋 超薄切片 以 2 醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色 在透射電鏡下觀 察細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒及細(xì)胞病理變化 A 3 2 病毒顆粒特性 A 3 2 1 草莓斑駁病毒 為伴生豇豆病毒科 Secoviridae 的未歸屬病毒 為 球狀病毒顆粒 直徑為 25 nm 30 nm 在葉片 的表皮和韌 皮部的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有晶狀球形顆粒 A 3 2 2 草莓輕型黃邊病毒 屬甲型線狀病毒科 Alphaflexiviridae 馬鈴薯 X病毒屬 Potexvirus 為線狀病毒顆粒 直 徑為 13 nm 長度為 470 nm 580 nm 分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi) A 3 2 3 草莓皺縮病毒 屬彈狀病毒科 Rhabdoviridae 質(zhì)型彈狀病毒屬 Cytorhabdovirus 為彈狀病毒顆粒 直徑 為 63 nm 75 nm 長度為 190 nm 380 nm 在植株表皮 導(dǎo)管和篩管附近的薄壁組織細(xì)胞內(nèi)均有分布 A 3 2 4 草莓鑲脈病毒 屬花椰菜花葉病毒科 Caulimoviridae 花椰菜花葉病毒屬 Caulimovirus 為球形病毒顆粒 直徑 為 40 nm 50 nm 主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制 存在于葉片表皮與木質(zhì)部相連的導(dǎo)管和細(xì)胞質(zhì)內(nèi) DB33 T 594 2017 7 B B 附 錄 B 資料性附錄 脫毒組培瓶苗 脫毒種苗的質(zhì)量要求 檢測(cè)方法 檢測(cè)規(guī)則 B 1 質(zhì)量要求 B 1 1 脫毒組培瓶苗質(zhì)量等級(jí)指標(biāo) 脫毒組培瓶苗質(zhì)量等級(jí) 指標(biāo)見表 B 1 表 B 1 脫毒組培瓶苗 質(zhì)量等級(jí)指標(biāo) 項(xiàng) 目 指 標(biāo) 優(yōu)質(zhì)苗 合格苗 株高 cm 6 0 4 0 根莖粗 mm 2 0 1 0 根條數(shù) 條 8 5 根長 cm 1 1 單株復(fù)葉片數(shù) 張 4 2 病毒檢測(cè)結(jié)果 不攜帶病毒 不攜帶病毒 外觀要求 生長健壯 無污染 無病斑 無爛莖 無爛葉 無爛根 B 1 2 脫毒種苗質(zhì)量等級(jí)指標(biāo) 脫毒種苗質(zhì)量等級(jí)指標(biāo)見表 B 2 表 B 2 脫毒種苗質(zhì)量等級(jí)指標(biāo) 項(xiàng) 目 指 標(biāo) 脫毒原原種苗 脫毒原種苗 脫毒生產(chǎn)用苗 脫毒率 100 97 90 外觀要求 種苗生長健壯 三葉一心 根系發(fā)達(dá) 無外源病害 根莖粗 0 6 cm 0 8 cm B 2 檢驗(yàn)方法 根 葉片采用目測(cè) 計(jì)數(shù)方法進(jìn)行 株高用分度值 1 mm的直尺測(cè)量 莖粗用游標(biāo)卡尺測(cè)量 B 3 檢驗(yàn)規(guī)則 B 3 1 組批規(guī)則 同一時(shí)間 同一地點(diǎn) 取得同一品種不同單株的外植體經(jīng)過組織培養(yǎng)培育的脫毒苗為同一檢驗(yàn)批次 B 3 2 檢驗(yàn)分類 DB33 T 594 2017 8 B 3 2 1 出廠 圃 檢驗(yàn) 由廠家執(zhí)行檢驗(yàn)組培瓶苗和脫毒種苗的株高 根莖粗 根條數(shù) 根長 單株復(fù)葉葉片數(shù) 并附有草 莓脫毒苗出廠 圃 合格證 B 3 2 2 型式檢驗(yàn) 型式檢驗(yàn)是對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的全部要求進(jìn)行檢驗(yàn) 在正常生產(chǎn)時(shí) 每年進(jìn)行一次 新建廠家和改變 工藝程序時(shí)也應(yīng)進(jìn)行型 式檢驗(yàn) B 4 判定原則 檢驗(yàn)結(jié)果全部符合本標(biāo)準(zhǔn)的 則判定該批次為合格種苗或優(yōu)質(zhì)苗 否則 則判定該批次種苗為不合 格 DB33 T 594 2017 9 C C 附 錄 C 資料性附錄 草莓脫毒苗出廠 圃 合格證 草莓脫毒苗病毒檢驗(yàn)報(bào)告 C 1 草莓脫毒苗出廠 圃 合格證 草莓脫毒苗出廠 圃 合格證 樣式 見表 C 1 表 C 1 草莓脫毒苗出廠 圃 合格證 編號(hào) 品種名稱 等級(jí) 原種采集地 病毒檢測(cè)單位 繁殖代數(shù) 種苗數(shù)量 購苗單位 質(zhì)檢員 生產(chǎn)單位 出廠 圃 日期 C 2 草莓脫毒苗病毒檢測(cè)報(bào)告 草莓脫毒苗病毒檢測(cè)報(bào)告 樣式 見表 C 2 表 C 2 草莓脫毒苗病毒檢驗(yàn)報(bào)告 送樣單位 品種名稱 原種采集地 送樣時(shí)間 原種數(shù)量 編 號(hào) 編號(hào) 草莓斑駁病毒 SMoV 草莓輕型黃邊 病毒 SMYEV 草莓鑲脈病毒 SVBV 草莓皺縮病毒 SCV